基因工程题目和答案

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1、1.重组DNA（基因工程）的主要步骤重组DNA技术一般包括四步：①产生DNA片段；②DNA片段与载体DNA分子相连接；③将重组DNA分子导入宿主细胞；④选出含有所需要的重组体DNA分子的宿主细胞。4.EST文库的构建基本流程及其应用。EST是长约100~300碱基对的cDNA片段，是表达基因的一部分。真核生物中比如说人类基因组中，仅有5%左右的DNA是编码序列，所以建立转录图，或从mRNA逆转录而来的cDNA，是分离、定位和克隆基因的关键，这里表达序列标签就具有重要的意义。只要分离到某一发育阶段某一组织的mRNA，就可以用逆转录法，从mRNA合成相应的cDNA片段，即EST，用它做探针，

2、就可以从基因组文库中筛选到全长的基因序列。EST的制备程序为：某特异组织→总RNA的提取→Poly（A）+mRNA→cDNA→两端加接头→与λzap载体连接、包装、裂解→转染E.coli的XLI—Blue细胞，进行invivoexcision用含有x-gal和IPTG的氨苄平板筛选→随机挑取白色菌落→提取质粒→M13活T7通用引物测序。随着后基因组时代的到来，EST将用于组织、细胞核亚细胞水平上，研究不同环境状态下的基因表达系统以及生物的系统发育。比较不同的EST数据，结合试验方法还可以获得单核苷酸多态性，可以建立更为个性化的基因图谱。这些研究材料将丰富和发展生物信息学，人们将开发模型植

3、物，定位与复杂疾病相关的基因，这将使基因组研究进入一个全新的阶段8.转基因沉默的可能原因转基因植物中转基因沉默已成为植物基因工程的一大障碍，转基因沉默的原因是多方面的，可能是由于转录前外源基因和内源基因的结构特性、伴置效应以及宿主植物的遗传调控；也可能是因为转录时启动子、转录因子和终止子的作用；还可能是由于转录后的修饰作用、外源基因表达特异性和环境等因素。为了克服转基因植物中转基因沉默，可以采取下列对策：选择适宜的外源基因和调控元件、采用适当的转化方法、使用更加简便快捷的筛选策略等。9.RNAi基本原理及应用10、酵母双杂交的原理和应用。1989年，Song和Field建立了第一个基于酵

4、母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统〔1〕。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-bindingdomain，BD）与转录激活域（Transcriptionalactivationdomain，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作

5、用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。酵母双杂交技术产生以来，它主要应用在以下几方面：(1）检验一对功能已知蛋白间的相互作用。(2）研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。通常需对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。其结果若与结构生物学研究结合则可以极大地促进后者的发展。(3)用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。(4)分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库。然后根据钓到的已知基因的功能推测该新基因的功能。11、怎样将一个平未端D

6、NA片段插入到EcolRI限制性位点中去？一种方法，将EcolRI限制性位点酶切后补平；另一种方法，重新设计引物加上EcolRI限制性位点，然后用EcolRI酶切后连接。后者更可行。但是无论怎么连，不能使用同一酶切两断，否则载体自连的效率会远多于你需要的连接，很难挑出阳性克隆。12、酵母单杂交技术的原理和应用。酵母单杂交技术最早是1993年由Lietal[1,2]从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究[3-6]，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控.目前认为真

7、核生物的转录起始需要转录因子的参与.这些转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个与其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA-bindingdomain,BD)和转录激活结构域(activationdomain,AD).用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子.研究[2]表明GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS);而转录