外排体介导的微小rna在猪细胞间的传递及其抗病毒作用

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1、祝悦：外排体介导的微小RNA存猪细胞问的传递及其抗病毒作用外排体介导的微小RNA在猪细胞间的传递及其抗病毒作用研究生：祝悦导师：孙怀昌教授摘要外排体(exoxome)是来源于真核细胞的纳米级小囊泡，含有多种生物活性分子，在细胞间物质和信息交流中发挥重要作用。最近的研究资料显示，外排体也是人和鼠源细胞小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)的传递机制之一，但能否在猪等哺乳动物细胞间传递尚无报道。为了阐明外排体能否在猪源细胞间传递干扰RNA，本研究首先构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(porci

2、nereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)3’非翻译区(UTR)特异性人工miRNA(amiRNA)的重组腺病毒rAd．amiR3UTR．EIRES．GFP和表达对照amiRNA的重组腺病毒rAd—amiRcon．EIRES—GFP。电镜观察结果显示两种重组腺病毒具有典型的腺病毒形态：经PCR检测证明重组病毒基因组含amiRNA表达盒；经RT-PCR检测证明重组腺病毒能感染猪源细胞并表达序列特异性amiRNA。分别用tAd—amiR3UTR．EIRES—GFP和rAd—amiRcon．EIRES—GFP感

3、染PK一15细胞系、3D4／21细胞系和原代PAM细胞，从感染细胞提取总RNA，用RT-PCR检测amiRNA表达。用腺病毒感染PK一15和3D4／21细胞系，培养三天后分别收集细胞和上清，并从上清中提取外排体，用半定量RT-PCR进行amiRNA检测。24孔板培养PAM细胞，分别加入腺病毒感染PK一15细胞源和3D4／21细胞源外排体，细胞继续培养48h后用PRRSV感染，感染后24h用PRRSV免疫血清进行免疫荧光检测，并收获病毒在MARC．145细胞上进行TCID50测定。结果显示：重组腺病毒感染的PK．15和3D4／21细胞都能表达序列特异的amiR

4、NA，并能以外排体方式分泌；分泌的含amiRNA外排体能传递给PAM细胞，并具有一定的抗病毒作用，PK．15细胞源外排体处理组的PRRSV滴度降低1．54log，3D4／21细胞源外排体处理组的病毒滴度降低1．13log。这些研究结果表明，外排体能介导序列特异miRNA在猪细胞间传递，并发挥抗病毒作用。关键词：重组腺病毒：微小RNA；猪源细胞；外排体传递；抗病毒作用扬州大学硕士学位论文2Exosome．MediatedMicroRNATransferbetweenPorcineCellsandItsInhibitoryEffectonVirusReplica

5、tionM．S．Candidatc：ZhuYueSupervisor：Prof．SunHuaichangABSTRACTExosomesareeukaryoticcell—derivedmicrovesicles，whichcontainavarietyofbioactivemoleculesandplayimportantrolesinmaterialandinformationexchangesbetweencellsRecentstudieshaveshownthatexosomesalsoplayallimportantroleinsmallinte

6、rferingRNA(siRNA)andmicroRNA(miRNA)transferbetweenhumanandmurinecells，buttheexosome-mediatedsiRNAormiRNAtransferbetweenporcinecellshasnotbeenreported．TostudytheroleofexosomesinartificialmicroRNA(amiRNA)transferbetweenporcinecells，inthepresentstudytworecombinantadenoviruses，namelyrA

7、d-amiR3UTR—EIRES-GFPandrAd-amiRcon-EIRES-GFP,whichexpressedtheartificialmiRNA(amiRNA)targeting3'-untraslatedregion(3'-UTR)ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)oracontrolamiRNA，weregenerated．Typicalmorphologyofadenoviruseswasconfirmedbyelectronmicroscopy．Thepresenc

8、eoftheamiRNAexpressioneass