微生物遗传操作系统

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1、转化、转导与接合转移最终受体菌基因转移重组DNA分子微生物遗传操作系统《微生物菌种选育》GeneticImprovementonMicroorganisms基因转移转化Transformation:细胞从环境中摄取DNA。只有“感受态”细胞才能摄取DNA。转导Transduction:病毒感染一个细胞后部分宿主DNA被包到新生病毒粒子中，该病毒粒子再感染另一个宿主细胞从而引起基因重组的现象。接合Conjugation:一个细菌通过细胞间的直接接触将DNA转到另外的细菌中，接合需要特殊的质粒辅助。转

2、化Transformation细菌细胞处于可被DNA转化的状态称为感受态。处于感受态的细胞表面有DNA受体和其他特异的转化蛋白。(1)自然感受态：(()2)化学感受态：(3)电转化/电穿孔(4)原生质体转化接合转移Conjjgugation指两个细胞通过直接接触或桥状结构进行基因转移的过程。接合转移需要利用质粒编码的功能辅助。http://strubi.uni-graz.at/projects/index.html接合转移质粒Conjugativeplasmid含有接合转移质粒的细菌才能发生接合转

3、移。大肠杆菌F质粒大肠杆菌RK2/RP4质粒农杆菌Ti质粒接合转移的基本元件1.接合起始区originoftransfer(oriTormob)：位于待接合的质粒上。2.接合转移基因(tragenes):tra基因可以位于待接合的质粒上，也可以位于供体菌的另一个质粒，甚至可以位于细菌基因组上。转导Transduction细菌利用噬菌体通过转导作用将基因组DNA转移到另一个细菌中。转染Transfection当细菌的转化过程中吸收的外源DNA是病毒DNA时此过程就应该称为转染。区别于“感染”，后者指

4、病毒颗粒借助于胞外受体吸附到细胞，并将DNA注入细胞。而对于真核生物，转染就是原核生物中转化的同义词。之所以在真核生物中使用“转染”这个词来代替“转化”，是因为人们之前已经习惯了用转化这个词表示真核细胞变为恶性细胞的过程。原生质体及原生质体融合《微生物菌种选育》GeneticImprovementonMicroorganisms原生质体概念Protoplast:用溶菌酶除尽原有细胞壁或用青霉素抑制细胞壁的合成，所留下的仅由细胞膜包被着的脆弱细胞，主要是G+菌Sppphaeroplast:还残留有部

5、分细胞壁的原生质体，主要是G-菌广义概念：实验室条件下脱掉部分或全部细胞壁的植物、真菌、细菌细胞。链霉菌菌丝原生质体Hopwood,2007原生质体特点：1.无细胞壁。2.球形。3.脆弱。4.对渗透压敏感。高渗的溶液将导致原生质体缩小。低渗导致原生质体破裂。等渗溶液！！！！细菌去壁：细菌细胞壁主要为肽聚糖.•加甘氨酸/青霉素培养，抑制肽聚糖的合成；•加溶菌酶处理除去肽聚糖。溶菌酶：切开肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4-糖苷键。原生质体再生：原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的

6、细胞形态结构和功能。微生物原生质体融合（ProtoplastFusion）将两个亲本的原生质体在等渗溶液中混合，加入物理的（电融合）、化学的（聚乙二醇）或生物的（仙台病毒）助融条件，使两个亲本的原生质体发生相互凝聚，通过细胞质、细胞核融合，产生暂时的核、质异质体/异核体，继而发生基因组间重组，最后再生出细胞壁得到重组子。促融合剂：PEG(p(pyolyethylenegyglycol)聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合。动物细胞融合：仙台病毒、羟基磷灰石、PEGPEG对细胞尤其是原生质体有

7、一定的毒害作用，因此作用的时间一般不宜过长。微生物的原生质体只需要与PEG接触5分钟，就应尽快加入缓冲液进行稀释。链霉菌原生质体融合PEG浓度很关键，最适浓度(W/V)依分子量/聚集度而定。同一浓度下高分子量者具有更低的渗透压但粘度更高。实际常用分子量为1000-6000，1000更好，使用浓度50%。很少用60%以上的PEG,因为过于粘稠。钙离子（由PBuffer提供）融合时间几分钟即可。融合前用紫外照射适当处理（1%存活率），可提高重组频率。无性进化Asexualevolutiondelete

8、riousmutationsFig.Asexualversussexualevolution.Figure2aGenomeshufflingversusclassicalstrainimprovement.a:ComparisonofclassicalstrainimprovementtogenomeshufflingforproductionoftylosinfromSforproductionoftylosinfromS.fradiae.SF21wasgeneratedthro