南江黄羊和波尔山羊骨骼肌卫星细胞增殖分化能力的比较

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1、万方数据SichuanAgriculturalUniversityMasterDegreeDissertationComparisonofproliferationanddifferentiationcapacityofskeletalmusclesatellitecellsinNanjiangyellowgoatandBoergoatChenLiDirectedbyProf．LiLiProf．ZhangHong—pingAnimalGeneticsandBreedingMolecularGenetic

2、sandGoatBreedingYa’an，Sichuan，ChinaJune，2014万方数据论文指导小组成员王林杰(副研究员)仲涛(副研究员)本论文由国家星火计划重大项目(2012GA810001)、四川省科技支撑计划(2011NZ0003，2011NZ0099-36)资助在四川农业大学“畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室”完成万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的序果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个

3、人茑集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的等位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文[f作了明确的说明并表示了谓}意。研究生签名：甲茕--s,,oc贮年石月rD日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留旁向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采斥影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意IN／ll农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学

4、位论文的全部或部分内容。口本论文不保密。(请在以上口内划“4”)研究生虢豫剖导师签名口本论文保密，在一年解密后适用本授权。沙l∞年6月fo日咖，驻年6月(o日，万方数据摘要骨骼肌卫星细胞(Skeletalmusclesatellitecells，SMSCs)作为一种肌源性干细胞，对出生后骨骼肌的生长和肌肉受损后修复有重要作用。本试验以初生南江黄羊和波尔山羊背最长肌为材料，O．2％链酶蛋白酶消化后，采用Percoll液密度梯度离心法纯化并通过形态学和PAX一7免疫荧光染色鉴定收集到的SMSCs。通过血球计

5、数板和CCK．8试剂盒检测比较南江黄羊和波尔山羊SMSCs0—8d9个阶段的增殖能力；HE染色比较3—8d的SMSCs融合率。此外，为了获得稳定的内参基因以定量目标基因的表达，利用qRT-PCR检测了9个内参基因(fl-ACTIN、GAPDH、TOP2fl、YWHAZ、SDHA、PGKl、RP2、RPL4和胛尺丌)在不同阶段(1d、3d、4d和7d)SMSCs中表达量并运用geNorm软件筛选。我们进一步比较了SMSCs的标志基因PAX-7、MYOD、MYOG及p38MAPK信号通路中主要基因(尉刚、M

6、KK3、MKK6、p38MAPK、MEF2A和MEF2C)在两个品种不同培养阶段SMSCs(1d、3d、4d和7d)的表达差异，以探索调控SMSCs增殖分化能力差异的分子机制。结果如下：(1)PAX．7免疫荧光染色山羊的SMSCs呈阳性，且阳性率在95％以上，建立了体外获取高纯度山羊SMSCs的分离和纯化方法。(2)在相同条件下培养山羊的SMSCs发现第3d、4d和5d时南江黄羊SMSCs的数目都显著地高于波尔山羊(尸

7、4d和5d南江黄羊SMSCs的OD值显著高于波尔山羊(尸<0．01)，说明南江黄羊比波尔山羊SMSCs具有更强的增殖能力。(3)融合指数的检测发现南江黄羊和波尔山羊SMSCs都在第4d时进入快速融合阶段，第8d时融合率达80％左右，总体上南江黄羊SMSCs的融合率高于波尔山羊，且在第6d具有显著性(P<0．05)，暗示南江黄羊SMSCs的融合率高于波尔山羊。(4)9个内参基因在不同时期SMSCs中表达稳定度的由高到低的排序是：PGKl、SDHA、fl-ACTIN、RPL4、GAPDH、TOP2归、YWH

8、AZ、RP2、月凇丁，在不同生长阶段的SMSCs中表达最稳定的内参基因是PGKl；配对变异系数分析显示至少需要3个内参基因(PGKl、SDHA和脚CTIN)校正定量表达数据才能获得可靠的结果。(5)qRT-PCR检测PAX-7、MYOD和MYOGmRNA在SMSCs中的表达量，发现PAX-7在SMSCs的增殖期高表达，进入分化期后表达下降，且在增殖第1d和3d的南江黄羊SMSCs中的表达量都显著高于在波尔山羊(尸<0．05)；MYOD在增殖