实验十 聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离蛋白质

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1、实验十聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质【实验目的】1.了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；2.掌握用此法分离蛋白质组分的操作方法。【实验原理】在生物化学、分子生物学和基因（遗传）工程实验中，常常要进行蛋白质和核酸的分离工作。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PolyacrylamideGelElectrophoresis,PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质或核酸分离的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylenebisacrylsmide简称BIS）在催化

2、剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。通过改变单体浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，用于分离分子量大小不同的物质。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N,N,N,N－四甲基乙二胺（简称TEMED）。通常控制这二种溶液的用量，使聚合在1小时内完成。（2）光聚合：通常用核黄素为催化剂，通过控制光照时间、强度控制聚合时间，也可加入TEMED加速反应。聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。一般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：①电荷效应（电

3、泳物所带电荷的差异性）；②凝胶的分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）。③浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）。因此，样品分离效果好，分辨率高。SDS即十二烷基硫酸钠（SodiumDodecylSulfate，简称SDS）是阴离子表面活性剂，它能以一定比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低仍至消除。与此同时，蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋于一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的电泳迁移率的差异，仅

4、仅取决于蛋白质的分子量。另外，SDS-蛋白质复合物在强还原剂（巯基乙醇）存在下，蛋白质分子内二硫键被打开，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。本实验采用化学聚合法制胶，进行不连续的凝胶电泳，并用考马斯亮蓝快速染色，以分离和鉴定大肠杆菌菌体、发酵液中和纯化的蛋白产物。【试剂与器材】（一）试剂（(全班分两大组，每组配一份，如1－5组一份，6－10组一份)（1）30%的凝胶贮备液：ACR30g+Bis0.8g溶于100mL去

5、离子水中，用3号新华滤纸过滤至棕色瓶中，4℃避光贮存（1）。（2）3mol/LTris-buffer,pH8.9：Trisbase36.6g+1mol/LHCl48mL+ddH₂O至100mL）（3）0.5mol/LTris-HCl,pH6.8:6.05gTrisbase溶于40mLddH₂O中，加1mol/LHCl48mL,加水补至100mL.（4）5×Tris-甘氨酸电泳buffer（pH8.3):（配1L）Tris-base15.1g+甘氨酸94g+5gSDS+H2O至1L（用时稀释5倍）。（5）10%SDS:：称10克SDS溶解于100mL去离子水中，贮存于室温

6、中。（6）TEMED（四甲基乙二胺）：浓度10%，20mL(全班共用)，4℃保存。（7）10%AP（过硫酸铵）：10mL，新鲜配制，分装至1.5mL离心管中，－20℃保存待用（2）。（8）样品溶解液：内含1%SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.05mol/LpH8.0Tris-HCL缓冲液。*先配制0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称Tris0.6g，加入50ml重蒸水，再加入约3ml1mol/LHCL,调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100ml*按下表配制样品溶解液：*如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体

7、积混合。*或配制2XSDS样品缓冲液：  100mmol/L   Tris-HCl(pH6.8)          200mmol/L   DTT                4%          SDS                 0.2%       溴酚蓝                 20%        甘油必要时加入少量（1%）巯基乙醇。（9）考马斯亮蓝染色液(3)：0.05g考马斯亮蓝R250溶于25mL异丙醇里，加11mL冰醋酸+H2O至110mL，用滤纸过滤除去不溶物。（10）0.1%溴酚蓝指示剂（全班共用）（