平滑肌细胞原代培养、传代、冻存方法及所需试剂

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1、01年中国现代医学杂志贴壁法原代培养1.1　细胞培养1.1.1　培养液配制　DMEM(美国CorningCellgro公司),Hepes(15mmol/L),青霉素(100u/ml),链霉素(100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,上海普飞澳洲胎牛血清)。1.1.2　培养器皿　25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养皿。1.1.3　大鼠血管平滑肌细胞培养　动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体重150~180g。动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,

2、无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。每次取材2~3只大鼠。贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的2~3条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块。并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5c

3、m。盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37℃孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶壁贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养3~5d。待有细胞从组织块周围游出后换液。1.1.4　原代培养动脉VSMC的传代培养　当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面,室温下大约1~2min,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液3~4ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液。将

4、细胞悬液一分为二接种到新的培养瓶中,补足培养液(每瓶3~4ml)。未消失的组织块会随细胞换液、传代而除去。1.3　培养细胞的鉴定1.3.1　形态学　用相差显微镜常规观察细胞生长形态及生长规律,并依常规制作电镜标本进行观察。1.3.2　免疫组织化学鉴定　特异性鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(福建迈新生物技术公司),采用SP法对细胞爬片进行免疫组织化学染色。（α-SM-actin免疫组织化学鉴定）04协和中国动脉硬化杂志胰酶消化法培养平滑肌细胞1.1　试剂和动物胰酶购自CorningCellgro公司;α-actin抗体购自中山生物技术有限公司;PBS购自

5、CorningCellgro;新生小牛血清购自HyClone，DMEM为CorningCellgro产品。雄性Wistar大鼠(2只,体重175±25g)购自中国医学科学院实验动物中心。1.2　胰酶消化法原代培养Wistar大鼠处死,迅速取出胸主动脉,浸泡在含无菌PBS的表面皿中,转移到无菌超净台。在表面皿中漂洗主动脉去除残留的血迹,纵向剪开主动脉,把主动脉铺平并使内膜朝上,用镊子来回刮除内膜层,剥离血管中膜。将剥离的血管中膜用眼科剪剪碎,碎片大小在1mm×1mm左右。装入含0.25%胰酶的玻璃培养瓶中于37℃条件下消化。当在显微镜下观察组织块表面出现大量

6、细胞时应立即加入血清终止消化,一般消化的时间在3.5h。终止消化后将玻璃培养瓶置于37℃空气摇床振摇10min,继续用吹打的方法使组织块表面的细胞尽可能脱落。待细胞从组织块脱离后,120目细胞筛过滤,转入离心管内离心,弃上清,用含20%小牛血清的DMEM培养基吹打细胞,最后接种于25mL培养瓶,放入CO2孵箱培养,48h后换液。1.3　传代培养细胞融合后,倒去旧的培养液,加入适量的0.25%胰酶,显微镜下观察,见细胞收缩后去除消化液,加入适量培养液,吹打细胞,以1∶2接种于新培养瓶中,补足培养液,放入37℃、5%CO2孵箱培养。传代细胞从第三代开始可换用含

7、10%小牛血清的DMEM培养基培养。VSMC至少可以传16代以上,并且从第二代开始平滑肌细胞即可冻存。1.4　动脉平滑肌细胞的鉴定相差显微镜下,细胞未汇合之前多数呈梭形,至汇合后,部分区域细胞束状排列,呈典型的“峰和谷”状态。将传代获得的平滑肌细胞接种于盖玻片上,3~4天后至亚汇合状态,取出细胞爬片,PBS清洗后用4℃纯丙酮固定15~30min,自然晾干。采用小鼠抗大鼠α-肌动蛋白抗体免疫组织化学染色鉴定VSMC肌动蛋白。根据S-P免疫组织化学染色的常规方法,以平滑肌细胞胞浆棕黄色为阳性结果。05重庆医学/基础医学与临床1　材料与方法1.1　材料　9~12

8、d新生健康清洁级KM小鼠,雌雄不限,购自重庆医科大学实验动物中心。