四溴联苯醚(bde-47)对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究

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1、谨以此论文献给我的导师、家人和我的朋友；钆一t，；四溴联苯醚(BDE．47)对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究学位论文完成日期：塑如二手．／厂指导教师签字：={毒引E答辩委员会成员签字：：刍瓣甄_—罄塾—必哞k—酊独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得(注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空)或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论

2、文作者虢许越毕字慨知牌绷。日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下事项：1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社’’用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》，授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：谭超群签字日期：知卜年‘月／D日

3、导师签字签字日期：勘，p年r月习日四溴联苯醚(BDE47)对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究四溴联苯醚(BDE．47)对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究摘要多溴联苯醚(Polybrominateddiphenylethers，PBDEs)是一类新型的溴系阻燃剂，广泛应用于电子产品、涂料和各种纺织品中。由于PBDEs具有难降解性、稳定性、高脂溶性和生物放大作用，能够通过食物链的转移，使处于高位营养级的生物受到毒害，最终导致对人体的神经、内分泌、生殖系统造成危害。近年环境中PBDEs的浓度不断上升且已在世界各地普遍存在，又因PBDEs的化学结构与多氯联苯

4、(Polychorinatedbiphenyls，PCB)和滴滴涕(2，2-bis(4一Chlorophenyl)一1，1，1-trichloroethane，DDT)非常相似，因此PBDEs的环境毒性越来越受到学者们的关注。菲律宾蛤仔(Venerupisphilippinarum)是我国沿海重要的滩涂贝类。本论文以菲律宾蛤仔为研究对象，分别从分子生物学和酶学水平全面系统的研究了BDE．47对菲律宾蛤仔相关解毒代谢酶基因，解毒代谢酶活力及DNA损伤的影响，初步探讨了BDE．47在菲律宾蛤仔体内的毒性效应过程。1菲律宾蛤仔细胞色素P450(CYP4)基因的克隆、序列分析及组织

5、特异性本研究通过相近物种CYP4氨基酸序列的同源性比对，根据保守氨基酸序列设计兼并引物，成功调取CYP4的核心片段426bp。根据已知片段分别设计扩增3’和5’核酸序列的特异性引物，利用改良的TDT末端加尾法和RACE技术成功克隆了菲律宾蛤仔CYP4基因的完整eDNA序列。菲律宾蛤仔CYP4基因全长2107bp，开放性阅读框(openreadingframe，ORF)长1329bp，编码442个氨基酸。将菲律宾蛤仔CYP4的氨基酸序列与其它物种的CYP4氨基酸序列进行同源性比较发现，CYP4具有较高的保守性。通过RT-PCR技术研究发现，CYP4基因只在菲律宾蛤仔鳃，消化盲

6、囊及闭壳肌中表达，而外套膜和足中没有表达。二’2菲律宾蛤仔谷胱甘肽硫转移酶(GST-pi)基因的克隆、序列分析及组织特异性本研究通过相近物种GST氨基酸序列的同源性比对，根据保守氨基酸序列四溴联苯醚(BDE．47)对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究设计兼并引物，利用RT-PCR成功调取GST的核心片段309bp。根据已知片段分别设计扩增3’和5’核酸序列的特异性引物，利用改良的TDT末端加尾法和RACE技术成功克隆了菲律宾蛤仔GST基因的完整eDNA序列。菲律宾蛤仔GST●、全长l142bp，包括618bp的ORI：，并编码205个氨基酸。将菲律宾蛤仔GST的氨

7、基酸序列通过NCBI进行过BLAST后发现，菲律宾蛤仔GST基因隶属于pi亚族，且具有较高的保守性，其中和栉孔扇贝(ChlamysFarreri)的相似性高达91％。通过RT-PCR技术研究发现，GST-pi基因在菲律宾蛤仔鳃、消化盲囊、闭壳肌、外套膜和足中均有表达，且消化盲囊中的表达量相对较低。3BDE一47对菲律宾蛤仔鳃及消化盲囊中解毒代谢酶基因表达的影响本实验将菲律宾蛤仔暴露于不同浓度(O，0．25肛g／L和6．25“g／L)的BDE一47，并于0d，1d，3d，6d，10d，15d，21d分别取鳃和消化盲囊