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1、第35卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第5期2007年5月ChineseJournalofAnalyticalChemistry628~632基于磁性微球的固定化金属亲和载体及其在蛋白质/多肽纯化中的应用*石若冰张志超陈磊万谦宏(天津大学药物科学与技术学院,天津300072)摘要采用模板法制备的单分散磁性硅胶微球,经过表面修饰偶联上亚氨基二乙酸(IDA),与过渡金属离2+子Cu螯合,制成一种新型的磁性固定化金属亲和纯化载体。用牛血清白蛋白(BSA)作为模型进行磁性固定化金属亲和吸附蛋
2、白的研究,结果表明,BSA在磁性亲和载体上的吸附可用Langmuir吸附方程描述,对BSA的饱和吸附量为90mg/g。将磁性亲和载体用于带有组氨酸标签的镇痛抗肿瘤多肽(analgesic2antitumorpeptide,AGAP)纯化,在未经过滤的细胞裂解液中可以将AGAP一步纯化,非特异性吸附低,操作简便,完全适用于含有组氨酸标记的重组多肽或蛋白的分离纯化。关键词磁性微球,固定化金属亲和基质,蛋白质纯化,重组多肽1引言[1]2+2+2+2+固定化金属亲和纯化是利用过渡金属离子Cu、Ni、Zn
3、和Co等与氨基酸残基如组氨酸、半胱氨酸和色氨酸等的咪唑基、硫醇基和吲哚基的配位作用,有选择地分离对金属离子有亲和力的蛋白[2]质。分子生物学的发展使得从基因水平上设计重组蛋白的后续纯化成为可能。通过基因工程的方法在重组蛋白的末端加上多聚组氨酸的尾巴,使得其与金属离子的相互作用大为增强,在金属亲和载体上得以保留,与其它不含组氨酸标签的蛋白相分离,从而简化纯化操作。传统的亲和载体多以葡聚糖凝[3]胶(sephadex)和琼脂糖凝胶(sepharose)为基质,装入色谱柱中使用。为了避免对亲和载体的污
4、染和堵塞,样品中不能存在固体颗粒,因此,通常需要对细胞裂解液进行过滤、离心等复杂的前处理操作,再加上其价格昂贵和机械强度低,在科研和生产中都存在一定的困难。近年来,集磁性分离的操作简便性和金属亲和纯化的高选择性于一体的磁性金属亲和分离方法引起了人们的关注。含有氧化铁的交联琼[4,5]脂糖凝胶和苯乙烯聚苯乙烯微球是常用的磁化介质,商品化的磁珠多为此种基质。但是这些介质价格昂贵。因此,发展新型磁性微球并寻求其国产化,具有一定的科学意义和潜在的经济价值。文献[6~8]报道了磁响应性高、粒径分布均匀的磁
5、性硅胶微球的制备及其在生物样品中基因组脱氧核糖核酸(DNA)的提取。本实验进一步将磁性硅胶微球应用于重组多肽/蛋白的分离纯化。与其它磁性亲和介质相比,具有制备流程简单、价格低廉、配基与载体反应温和、容易实现配基功能化等优点。用牛血清白蛋白(BSA)作为模型蛋白对其在磁性介质上的吸附行为进行了研究。此磁性亲和纯化介质具有吸附带有组氨酸标记蛋白的特异性。2实验部分2.1试剂与仪器亚氨基二乙酸(分析纯,湖州生物化学厂);四乙氧基硅烷(TEOS)、C2缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷,商品名为KH2560(武
6、汉大学有机硅有限公司);牛血清白蛋白(BSA,天津厚普生物科技公司);低分子量蛋白质标准(上海生工试剂公司);其余试剂均为国产分析纯。大肠杆菌菌株BL21(DE3)及pET28a2AGAP质粒(沈阳药科大学惠长野)。UV22450紫外扫描仪(日本岛津公司);原子吸收光谱仪(日本日立公司);磁分离架(天津市倍思乐2006209211收稿;2006212208接受本文系国家自然科学基金资助课题(No.20375027、20575044)*E2mai:lqhwan@tju.edu.cn第5期石若冰等:
7、基于磁性微球的固定化金属亲和载体及其在蛋白质/多肽纯化中的应用629色谱技术开发中心);VC130超声波细胞破碎仪(美国SONICS);气浴摇床(国华企业SHZ282);DYY27TM型电泳仪(北京六一仪器厂);BioDoc2It紫外成像系统(英国UVP公司);电子扫描电镜(日本日立公司);振动磁强计(美国LDJ公司)。2.2实验方法2.2.1硅胶基质磁性微球的制备和表征磁性微球的制备参照文献[6],磁性微球的形貌和磁性特征由磁球的扫描电镜照片和磁滞回线来说明。2.2.2磁性金属亲和纯化介质的制
8、备由磁性硅胶微球表面的硅羟基化、环氧化、亚氨基二乙酸化和螯合金属离子等4个步骤组成。根据文献[9,10]对硅胶基质的磁性微球表面功能化修饰,得到表面羧基化的磁球,然后与15%CuSO4溶液室温混合放置12h,用蒸馏水洗去未结合的金属离子后,分散于蛋白吸附缓冲液(20mmol/LPBS,0.5mol/LNaCl,10mmol/L咪唑,pH8.0)中,得到浓度为50g/L的磁性金属亲和载体。2.2.3螯合金属离子浓度的测定取0.2g磁性微球,与4mL50mmol/LCuSO4溶液充分混合,在摇床中振
