中药材污染真菌毒素的液质联用高通量检测研究

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1、广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签日期：)钭17L年关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本

2、人授权广州中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者日期：论文导师签名摘要目的：建立一种适合中药材污染黄曲霉毒素Bl，B2，G1，G2，赭曲霉毒素A和杂色曲霉毒素的液质联用(LC．MS／MS)高通量检测方法；并应用该方法检测收集自广州地区不同药店和医院药房的中药材，从而初步了解该地区的中药材污染以上6种真菌毒素的现状，为国家管理部门制定相关的限量标准提供参考。方法：以中药材苦杏仁和太子参为

3、代表药材(分别代表果实种子类和根及根茎类中药材)，通过优化高效液相的色谱条件(流动相和洗脱梯度)、三重四级杆质谱仪的参数和样品前处理方法(提取溶剂、定容溶剂的选择和稀释法的应用)，以期提高整个检测系统对黄曲霉毒素B1，B2，Gl，G2，赭曲霉毒素A和杂色曲霉毒素的灵敏度，克服由中药材复杂的化学成分所引起的基质效应，从而提高LC．MS／MS检测方法的准确度；进一步，本研究采用黄曲霉素专用商品多功能净化柱Mycosep226纯化样品提取液，并比较柱纯化方法与本研究建立的前处理方法在黄曲霉毒素B1，B2，Gl和

4、G2回收率上的差异，探讨Mycosep226净化柱用于中药材污染四种黄曲霉毒素检测的适用性；最后，本研究将建立的新方法拓展至薏苡仁、枸杞子等其它37种中药材和花生等3种食品的检测，分别考察这些样品在高、中、低三个浓度水平的基质效应，以评估该LC．MS／MS方法的可行性和适用性。结果：本研究最终确定的样品制备和检测方法为：取中药材粉末(过三号筛)，加10mL84％乙腈(体积比)涡旋振荡提取70min后，取250IlL的上清液在氮气下吹干，残渣加入1mL色谱甲醇复溶，最后经过0．22lim的有机微孔滤膜过滤，

5、直接进样检测(10此)；以C18色谱柱为固定相，4．0mmol／L醋酸铵一0．1％甲酸水溶液(水相)和甲醇(有机相)为流动相，采用梯度洗脱的方式，样品经色谱分离后注入三重四级杆质谱仪，在选择反应监测模式(SRM)下检测(ESI+)6种真菌毒素的峰面积，通过外标法计算相应的浓度。经方法学验证，黄曲霉毒素B1，B2，Gl，G2，赭曲霉毒素A和杂色曲霉毒素在各自的质量浓度范围内线性关系良好，r>0．995，两种代表中药材在高、中、低3个浓度水平的绝对回收率为84．8％'～110．6％，提取回收率为83．6--1

6、06．1％，定量限为1．6～25．0ng／L，精密度RSD<9．9％，长期稳定性表明该检测系统在一个月内的稳定性良好，RSD<9．8％；而对比实验的结果显示所建立的方法与使用Mycosep226净化柱纯化样品的方法相比，具有准确度更高、操作更简便和检测成本更低等优点。在考察的39种中药材中，薏苡仁和党参等25种的基质效应80．2％～118．6％，该偏差与文献报道的允许范围一致，表明基质效应不会对这些中药材的准确定量造成影响，可忽略不计，并且相应药材样品的检测结果可采用外标法进行定量换算；而红枣和红参等其他

7、14种中药材的考察结果显示，每种药材均有1或2个真菌毒素的基质效应小于80％或大于120％，表明中药材产生的基质效应会对这些真菌毒素的检测结果产生一定影响，该LC．MS／MS方法仍存在一定的局限性。对收集自广州地区5家大型连锁型药店和5家三甲医院中药房的39种中药材共365份样品的LC．MS／MS检测结果显示，中药材污染杂色曲霉毒素的情况最严重(污染率23．8％)，其次是黄曲霉毒素B1(7．9％)、赭曲霉毒素A(4．4％)和黄曲霉毒素B2(3．8％)，最后是黄曲霉毒素Gl(1．6％)和G2(0．3％)。利

8、用本论文的方法测得大米、花生和玉米三种食品的基质效应为82．1％-118．3％，表明该方法同样适用于这三种样品的高通量检测。对购买自广州地区5家超市共16份样品的检测结果发现，样品中污染最严重的真菌毒素是黄曲霉毒素B1(25．0％)，其次是杂色曲霉毒素(18．8％)、黄曲霉毒素B2(12．5％)和G2(6．3％)，但未见黄曲霉毒素G1和赭曲霉毒素A的污染。结论：本研究建立的LC．MS／MS方法具有预处理简便、经济等优点，样品无