欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:33413911
大小:7.91 MB
页数:51页
时间:2019-02-25
《hdll1ext-fc融合蛋白在cho-s细胞的表达纯化与初步鉴定》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得垃僦或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名:潘考签字日期:加岛年J月哆日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解幺臻文≠好有关保留、使用学位论文的规定,有权保留并向国家有关部f-j或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权糨以将学位论文的全部或部分内容编入有
2、关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名:】高考签字日期:山f弓年y月土≥日学位论文作者毕业去向:占6,业工作单位:通讯地址:导师签名:签字日期:电话:邮编:瑚数20l备年5只23B缩略词表lIIIIIIIIIllllIIIIJIfY2579608中文摘要hDnl吐Fc融合蛋白的表达纯化与初步鉴定摘要Notch基因首先在果蝇体内发现,由于该基因的缺失会导致果蝇翅膀边缘出现缺口(notch)而得名。Notch信号传导通路广泛存在于脊椎与非脊椎动物体内,它是决定细胞命运的重要路径之
3、一【ll。Notch受体是由胞外区(extracellularNotch,ECN)和跨膜区/胞内区(Notchtransmembrane,NTM)两个亚基组成的异二聚体,二者是通过共价键结合在一起的,并具有Ca2+依赖性t2]。哺乳动物中有多重Notch配体,与Delta高度相似的配体称为Delta或Delta样(Delta-like,D11),与Serrate相似的称为Serrate或Jagged。目前发现人的notch配体共有5种,即Delta.1ike.1,Delta-like.3,Delta—like-4,Jaggedl,Jagged2【31。作为人重要
4、Notch配体之一的Delta样配体1是由723个氨基酸组成的单次跨膜蛋白,其中胞外区含有539个氨基酸,由1个N端保守的DSL(Delta/Serrate/La92)基序和8个表皮生长因子样重复序列(epidermalgrowthfactor-liker印眺,EGF.R)结构域组成,具有重要的生物学活性【4】。该DSL结构域结合Notch受体,促进受体异二聚体分离,进而受体活化激活下游信号,Notch受体经过三次剪切,最终胞内区释放到细胞核,激活发状分裂相关增强子(hairyandenhancerofsplit,Hes)等靶基因的转录,进而调节细胞分化和组织发
5、生[51。胞内域功能还不太清楚,有研究表明Deltal的胞内区能够诱导细胞的生长抑制【6】。近几年研究表明Notch信号传导通路与肿瘤发生有关,如PurowBW等人在2005年发现Notchl及Notch4配体Delta.1ike-1、Jaggedl在多种神经胶质细胞瘤中过度表达,并且在联合其他细胞因子的情况下,hDlll胞外区可以抑制造血干细胞的分化并促进其增殖【.71。鲁茁壮等克隆表达了人Notch配体Delta-like一1(1圆111)的胞外区,并经过集落培养检测证实其对原始的造血祖细胞具有扩增作用【引。终上所述,根据已知序列,将合成hDlll嘣基因片段
6、经PCR扩增,NheI和BamHI双酶切后连接至plRES2.EGFP.Fc中,取连接产物转化感受态细胞,涂于含有kana+抗性的LB固体筛选培养基上,倒置过夜,次日挑选阳性克隆,经菌落PCR验证正确后测序,将正确的重组质粒转染至CHO—S细胞,经G418筛选中文摘要高表达细胞系,利用rProteinA亲和柱纯化目的蛋白,并通过检测Notch下游信号分子Hesl的表达及双荧光素酶报告基因实验检测蛋白活性。结果筛选得到了高效表达hDlll自【t-Fc的CHO—S细胞株10C7,经WAVE培养密度最高达到6.27×106cclls/mL,培养近2周后,细胞大量死亡收
7、得上清体积约1.1L,测定上清中目的蛋白浓度为47.8gg/mL,估计得到总目的蛋白为52.58mg。将上述上清经rProtcinA亲和柱纯化获得较高纯度的融合蛋白,BCA试剂盒测得蛋白浓度为1.5mg/mL,体积为30mL,最终得到的目的蛋白总量为45mg,可以得到rProteinA亲和柱回收率为45mg/52.58mg=85.6%。配合生物活性检测实验显示,可溶性的hDlll鼠t_Fc能够激活Hesl报告基因,并且能上调Notch下游分子Hesl的表达,证实其可以激活Notch通路。本实验通过纯化获得的较高纯度的具有生物学活性的hDlll哺一Fc融合蛋白,为
8、后续研究它的功能奠定了重
此文档下载收益归作者所有