hdll1ext-fc融合蛋白在cho-s细胞的表达纯化与初步鉴定

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2、关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：】高考签字日期：山f弓年y月土≥日学位论文作者毕业去向：占6，业工作单位：通讯地址：导师签名：签字日期：电话：邮编：瑚数20l备年5只23B缩略词表lIIIIIIIIIllllIIIIJIfY2579608中文摘要hDnl吐Fc融合蛋白的表达纯化与初步鉴定摘要Notch基因首先在果蝇体内发现，由于该基因的缺失会导致果蝇翅膀边缘出现缺口(notch)而得名。Notch信号传导通路广泛存在于脊椎与非脊椎动物体内，它是决定细胞命运的重要路径之

3、一【ll。Notch受体是由胞外区(extracellularNotch，ECN)和跨膜区／胞内区(Notchtransmembrane,NTM)两个亚基组成的异二聚体，二者是通过共价键结合在一起的，并具有Ca2+依赖性t2]。哺乳动物中有多重Notch配体，与Delta高度相似的配体称为Delta或Delta样(Delta-like，D11)，与Serrate相似的称为Serrate或Jagged。目前发现人的notch配体共有5种，即Delta．1ike．1，Delta-like．3，Delta—like-4，Jaggedl，Jagged2【31。作为人重要

4、Notch配体之一的Delta样配体1是由723个氨基酸组成的单次跨膜蛋白，其中胞外区含有539个氨基酸，由1个N端保守的DSL(Delta／Serrate／La92)基序和8个表皮生长因子样重复序列(epidermalgrowthfactor-liker印眺，EGF．R)结构域组成，具有重要的生物学活性【4】。该DSL结构域结合Notch受体，促进受体异二聚体分离，进而受体活化激活下游信号，Notch受体经过三次剪切，最终胞内区释放到细胞核，激活发状分裂相关增强子(hairyandenhancerofsplit，Hes)等靶基因的转录，进而调节细胞分化和组织发

5、生[51。胞内域功能还不太清楚，有研究表明Deltal的胞内区能够诱导细胞的生长抑制【6】。近几年研究表明Notch信号传导通路与肿瘤发生有关，如PurowBW等人在2005年发现Notchl及Notch4配体Delta．1ike-1、Jaggedl在多种神经胶质细胞瘤中过度表达，并且在联合其他细胞因子的情况下，hDlll胞外区可以抑制造血干细胞的分化并促进其增殖【．71。鲁茁壮等克隆表达了人Notch配体Delta-like一1(1圆111)的胞外区，并经过集落培养检测证实其对原始的造血祖细胞具有扩增作用【引。终上所述，根据已知序列，将合成hDlll嘣基因片段

6、经PCR扩增，NheI和BamHI双酶切后连接至plRES2．EGFP．Fc中，取连接产物转化感受态细胞，涂于含有kana+抗性的LB固体筛选培养基上，倒置过夜，次日挑选阳性克隆，经菌落PCR验证正确后测序，将正确的重组质粒转染至CHO—S细胞，经G418筛选中文摘要高表达细胞系，利用rProteinA亲和柱纯化目的蛋白，并通过检测Notch下游信号分子Hesl的表达及双荧光素酶报告基因实验检测蛋白活性。结果筛选得到了高效表达hDlll自【t-Fc的CHO—S细胞株10C7，经WAVE培养密度最高达到6．27×106cclls／mL，培养近2周后，细胞大量死亡收

7、得上清体积约1．1L，测定上清中目的蛋白浓度为47．8gg／mL，估计得到总目的蛋白为52．58mg。将上述上清经rProtcinA亲和柱纯化获得较高纯度的融合蛋白，BCA试剂盒测得蛋白浓度为1．5mg／mL，体积为30mL，最终得到的目的蛋白总量为45mg，可以得到rProteinA亲和柱回收率为45mg／52．58mg=85．6％。配合生物活性检测实验显示，可溶性的hDlll鼠t_Fc能够激活Hesl报告基因，并且能上调Notch下游分子Hesl的表达，证实其可以激活Notch通路。本实验通过纯化获得的较高纯度的具有生物学活性的hDlll哺一Fc融合蛋白，为

8、后续研究它的功能奠定了重