厌氧真菌与产甲烷菌共培养系统的建立及其代谢与菌群变化的研究

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1、南京农业大学博士学位论文厌氧真菌与产甲烷菌共培养系统的建立及其代谢与菌群变化的研究姓名：成艳芬申请学位级别：博士专业：动物营养与饲料科学指导教师：朱伟云20081201中文摘要厌氧真菌与产甲烷菌共培养系统的建立及其代谢与菌群变化的研究摘要甲烷是瘤胃微生物代谢的终产物之一，它的产生既损失能量，又增加温室气体负荷，因此瘤胃产甲烷茵的研究越来越受到重视．本论文报告了来自瘤胃内容物的混合厌氧真菌与产甲烷菌在产甲烷过程中的相互关系。首先建立了瘤胃产甲烷菌DGGE分析方法；通过体外连续传代培养获得厌氧真茵与产甲烷菌的共培养物，研究产甲烷菌对厌氧真菌代谢的影响

2、，厌氧真菌活力对甲烷茵甲烷产生能力的影响及传代过程中真菌与产甲烷茵菌群的变化；最后，分离培养相关瘤胃厌氧真菌与产甲烷茵．试验共分为4部分：1瘤胃古菌DGGE分子生态学研究方法的建立本试验建立了瘤胃古菌16SrRNA基因的DGGE分析方法．首先利用瘤胃液总DNA及细菌DNA，比较了10对用于古茵16SrRNA基因DGGE分析的PCR引物．其中6对为直接PCR扩增引物，4对巢式PCR扩增引物．经过PCR初步筛选，确定三对直接PCR扩增引物(519f／915rGC，1106fGC／1378r和344／GC／915r)可用于瘤胃古菌的DGGE分析．引物5

3、19ff915rGC和1106fGC／1378r得到了条带清晰的DGGE电泳图谱，从图谱中分别获得33个和6个条带，而引物344tU_JC／915r的DGGE图谱中只得到一条电泳条带。将所有DGGE图谱中的条带切胶回收核酸，克隆，测序．所有条带都属于产甲烷茵16SrRNA基因序列．结果显示，引物519f／915rGC能扩增瘤胃液得到较好的PCR产物，该产物用于DGGE电泳，获得条带清晰的电泳图谱，测序结果表明，DGGE胶上的条带属于甲烷短杆菌及一类未培养产甲烷茵，该引物较适合用于瘤胃古菌的DGGE分析。2瘤胃厌氧真菌与产甲烷菌共培养系统的建立及菌

4、群多样性分析根据瘤胃微生物对抗生素的敏感性，用青霉素和链霉素抑制细菌生长，通过体外分离培养方法获得厌氧真菌与产甲烷茵共培养液．对共培养传代62次，取第5、15、25、35、45、55、62代共培养液样品进行分析，研究该共培养液中厌氧真茵与产甲烷茵的种类及多样性变化．结果显示：瘤胃液中厌氧真茵复杂多样，ARISA图谱中共出现13个峰；但在厌氧真菌与产甲烷菌的共培养液中，厌氧真茵多样性降低，从第5南京农业大学博士学位论文厌氧真菌与产甲烷菌共培养系统的建立及其代谢与菌群变化的研究代至62代，ARISA图谱相似，只出现3个峰；这些厌氧真菌在共培养液传代过

5、程中一直稳定存在．瘤胃液中的产甲烷菌复杂多样，DGGE图谱中共出现17个条带；共培养液中，产甲烷菌多样性降低，但与厌氧真菌相比较为复杂；随着共培养液的传代培养，产甲烷茵多样性逐渐降低，到第62代时，产甲烷菌DGGE图谱中仅有2个条带。对第25代共培养液中的产甲烷菌进行克隆测序，共得到13个不同的16SrRNA基因序列，其中12个与甲烷短杆菌相似，剩下的一个基因序列与现有的甲烷茵序列相似性低于80％，可能属于甲烷茵的一个新的目。根据该新的可培养未知产甲烷菌16SrDNA序列的特征，设计了一对特异性引物扩增该产甲烷茵，并对PCR扩增条件进行了优化，建

6、立了该产甲烷菌的PCR检测方法。综上所述：本研究建立了厌氧真菌与产甲烷菌体外共培养体系，并分析了共培养体系中的菌群多样性，与瘤胃剜目比，共培养系统中厌氧真菌菌群较为简单，共培养体系中的产甲烷菌主要是甲烷短杆茵和一类可培养的未知产甲烷菌，进而建立了该可培养未知产甲烷茵的PCR检测方法．3厌氧真菌活力及传代频率对真菌与产甲烷菌共培养液的影响厌氧真菌体外传代培养时，其活力受每代生长时间(即传代频率)的影响．本试验从瘤胃中获得厌氧真菌与产甲烷茵共培养液，．以不同的传代频率(3酬弋，5d／代，7彤代)进行连续传代培养，共传代9次，测定不同传代频率下，共培养

7、液的发酵产气量、代谢产物、厌氧真菌多棒陛、产甲烷菌多样性及检测新的可培养未知产甲烷茵．结果显示：三种不同传代频率的共培养液中，只有少量乳酸(基本低于1．5mM)、甲酸(低于0．1raM)、丙酸、丁酸和戊酸存在；各培养液pH值差异不显著(处于6．5+0．2范围内)；5d和7d传代的共培养液的总产气量(高于200mL)显著高于3d传代的共培养液(低于150mL)；在7d传代的共培养液中，其24．72h的平均产气量呈现明显的波动；7d传代的共培养液中甲烷产量显著高于3d和5d传代的共培养液；共培养液在传代过程中厌氧真菌的多样性逐渐降低，到第9代时趋于稳

8、定，此时5d和7d传代的共培养液中厌氧真菌的种类与3d传代的共培养液不同；在共培养液的整个传代过程中产甲烷菌菌群一直维持复杂多样，没有明