igf-1在糖尿病大鼠膀胱和腰骶背根神经节的表达

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1、河北医科大学硕士学位论文IGF--1在糖尿病大鼠膀胱和腰骶背根神经节的表达姓名：李小伟申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：郭跃先201203中文摘要IGF-1在糖尿病大鼠膀胱和腰骶背根神经节的表达研究摘要目的：糖尿病性膀胱病是一种糖尿病并发的泌尿系统的疾病，主要由糖尿病的周围神经病变引起的膀胱功能障碍，与其病程、是否系统治疗及神经病变程度相关，而与性别、年龄无关。糖尿病膀胱神经病变主要累及支配膀胱的副交感神经(骶2、3、4)以及交感神经(胸1l、12及腰1、2)，引起排尿反射出现异常，膀胱收缩力减弱，导致尿潴留或尿淋漓不尽，甚至出现尿失禁。患者有下腹胀痛、尿频、尿急、尿痛而无力排尿等症状

2、。膀胱内长期存在残余尿液易引起泌尿系的感染，导致肾功能出现损害，甚至发生肾功能衰竭。因此，糖尿病性膀胱病的早期诊断及治疗是十分非常重要的，其机制研究越来越受人们关注。近年来，发现胰岛素生长因子．1在神经元和肌肉中分布广泛，其化学结构与胰岛素相似，和其相应的受体结合而发挥作用，促进神经细胞和肌细胞的再生，抑制其凋亡，在神经元的生长、分化和能量代谢以及神经保护方面都起着重要的作用。本研究运用免疫组化的方法，检测胰岛素生长因子．1(IGF．1)在糖尿病大鼠膀胱和腰骶背根神经节组织中的表达变化，来探讨IGF．1在糖尿病性膀胱病的发生发展中的作用。方法：1实验的动物及分组：所用的动物为河北医科大学实验

3、动物中心的35只Sprague．Dawley(SD)雄性大鼠，体重为200．2509。随机分为两组，对照组为15只，糖尿病组20只；SD大鼠禁食12h以上(过夜)，糖尿病组大鼠按60mg／Kg腹腔注射STZ，对照组大鼠按60mg／kg腹腔注射枸橼酸钠缓冲液；72h后测大鼠空腹血糖浓度(BG)，BG>16．7mmol／L，ll周后糖尿病组大鼠的空腹血糖浓度(BG)>l6．7mmol／L，说明糖尿病大鼠并发膀胱病变。2标本的制作及免疫组化：大鼠麻醉后，分别取实验组和对照组大鼠膀胱及腰骶背根神经节，生理盐水冲洗一次，放入4％多聚甲醛(O．1MPBS，PH7．O～7．6，含O．1％DEPC)瓶中进行

4、固定，取O．5emx0．5cmx0．1cm组织块放入Citadel2000型脱水机中文摘要进行脱水处理后，高温熔解固体石蜡，在模具内包埋组织块；免疫组化的试剂是采用河北博海生物工程开发有限公司分装美国SANTACRUZ公司产品，按照说明书操作，具体步骤为：(1)将厚度5um的组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，60℃过夜；(2)将切片放入二甲苯和酒精中脱蜡、入水(二甲苯中5分钟两次、100％乙醇5分钟两次、95％乙醇5分钟两次、90％乙醇5分钟两次、85％乙醇5分钟两次、75％乙醇5分钟两次)蒸馏水洗两次；(3)将切片放入柠檬酸抗原热修复液中，微波炉加热后冷却至室温(100％火力一分钟、

5、20％火力一分钟、停一分钟，共四次)，用蒸馏水冲洗；(4)加3％H202孵育10分钟，消除内源性过氧化物的活性，蒸馏水冲洗1次，0．1MPBS洗2次(每次5分钟)；(5)切片上滴加正常的山羊血清封闭液，在室温下放置20分钟。甩去多余的液体，不洗；(6)切片上滴加适当比例(1：300)的第一抗体，放在冰箱内4。C过夜，取出切片，O．1MPBS洗2次(每次5分钟)；(7)切片上滴加生物素化第二抗体(IgG)，在37℃环境下放置20分钟，O．1MPBS洗2次(每次5分钟)；(8)切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A／HRP)，放在37℃环境下20分钟，0．1MPBS洗2次(每次5分钟)，拭

6、干；(9)DAB显色：DAB显色试剂盒加入lml蒸馏水，再将显色剂A、B、C各一滴加入试剂盒内，混匀，加至标本上，显色1分钟(显微镜下观察显色效果)，充分水洗；(10)苏木素复染细胞核1分钟，取出充分水洗，使其返蓝复染、脱水、烘干(1％盐酸酒精分化、1％胺水反蓝、充分水洗、经70％乙醇5分钟、80％乙醇5分钟、90％乙醇5分钟两次、95％乙醇5分钟两次、100％乙醇5分钟两次脱水、二甲苯透明5分钟两次)、中性树脂封片；(11)结果的观察：光学显微镜下观察，细胞核或细胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞，根据着色强度和阳性细胞的百分比，选择实验组和对照组的阳性和阴性组织相，进行100x和40

7、0×的显微照相，读取数据。3统计学分析：应用SPSSl3．0软件包，血糖结果采用均数4-标准差表示，进行两个独立样本t检验，当P值16．7mmol／L)，取材时，糖尿病组(n_19)的血糖明显高于对照组(n_15)