牛分枝杆菌新型融合抗原的制备与在牛结核抗体检测中的应用

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1、牛分枝杆菌新型融合抗原的制备及在牛结核抗体检测中的应用摘要牛结核病(BovineTuberculosis，bTB)是一种严重危害养牛业的、慢性消耗性人兽共患病，主要由牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis，Mbovis)感染所致。同时，牛分枝杆菌是人结核病的重要致病因子之一，野生动物是牛结核分枝杆菌重要的储存宿主。目前国内外控制家畜和野生动物结核病普遍采用“检疫一扑杀”的措施，因此，准确及时的诊断结核病对有效控制该病、保障动物和人类健康显得极为重要。目前法定的牛结核检疫方法是结核菌素皮内变态反应(Tuberculinsk

2、intest，TsT)，由于TST具有劳动强度大、操作复杂、费时、与卡介苗和非结核分枝杆菌等具有交叉反应等缺陷，牛结核病检测需要探索更加灵敏快速的检测方法。发达国家的实践也证实，控制或根除牛结核病非常有必要依靠实验室检测方法。国际兽疫局(OIE)也推荐使用皮试以外的方法，如IFN一Y体外释放法、抗体检测法等。这些方法的关键之一就是选择灵敏特异的刺激抗原或诊断抗原。牛分枝杆菌感染机体过程中分泌多种抗原，使用单个抗原检测其抗体水平或刺激IFN一Y体外释放时灵敏度较低。研究证明，“鸡尾酒”诊断方法能提高诊断的敏感性，但使用多种蛋白抗原存

3、在生产费时费力，使用时配比不均，难于进行标准化生产等问题。鉴于以上原因，本研究对三种RDI区缺失基因Rv3872、CFP10和ESAT6进行了融合表达Rv3872一CFP10一ESAT6(RCE)三蛋白，该蛋白可以区分卡介苗与毒力型结核分枝杆菌与牛分枝杆菌，并将Rv3872基因插入70一83一CE蛋白基因的前面，融合表达了Rv3872一MPB70一MPB83一CFP10一ESAT6(RS)五蛋白，旨在为牛结核病临床诊断提供更加敏感、特异的诊断抗原。同时，建立了RCE间接ELISA方法，制备了RCE一胶体金试纸条并进行了初步应用。本

4、研究的主要内容如下:1.两种融合蛋白表达载体的构建、抗原的表达纯化克隆了牛结核分枝杆菌RDI区基因Rv3872，构建了原核表达载体pET一28a一RcE和pET一28a一Rv3872一70一83一CE，诱导表达融合蛋白，并用亲和层析法进行纯化，得到了纯度较高的RCE蛋白，但RS蛋白在纯化时遇到困难，无法去除大部分杂带，这可能与串联基因过多有关2.两种融合蛋白特性分析ELISA和Westemblot分析显示:两种融合蛋白均能与牛结核分枝杆菌阳性血清发生特异性反应，而与牛副结核病、牛布氏杆菌病、牛巴贝斯病和牛传染性鼻气乙华中农业大学2

5、010届硕士研究生学位论文管炎病阳性血清不反应。热稳定性试验证明两种融合蛋白热稳定性相似，在超过60℃温度处理一小时后，活性迅速降低。两种融合蛋白初步应用于ELISA，分别与本实验室克隆表达的CE蛋白和70一83一CE比较，结果显示，融合蛋白RCE比CE蛋白有更高的敏感性，而RS蛋白则可能由于串联的基因过多，各蛋白结构域互相覆盖部分抗原位点，导致敏感性远低于四联蛋白。说明RCE蛋白作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。3.RCE蛋白间接ELIsA方法的建立和胶体金试纸条的制备通过方阵滴定，确定RCE一ELISA最佳工作条件:抗

6、原的最佳包被浓度为巧.625ng/mL，封闭液为5%的脱脂奶粉。一抗卜100倍(体积比)稀释，酶标二抗1:10000倍(体积比)稀释，滴加底物液反应10分钟后0.25%HF终止显色。RCE一胶体金试纸条最佳制备条件:抗原标记胶体金的最佳pH值为8.0，每毫升胶体金溶液中抗原最适标记量为224林g。检测线最佳抗原包被浓度为1.4mg加工，质控线最佳IgG包被浓度为3.Omg/mL。交叉试验证明试纸条不与牛的其它非相关疾病的阳性血清反应，具有较高的特异性。检测同一份阳性牛血清进行比较实验，结果RCE一胶体金试纸条的敏感性比进口试纸条高

7、4倍，证明其敏感性显著高于进口试纸条。4.RCE蛋白间接ELISA和胶体金试纸条在临床牛结核检测中的应用使用RCE一间接ELISA方法检测323份临床牛血清样本，其中TST阳性和阴性样本各为119和204份。ELISA和TST总符合率达到79.57%。RCE较CE蛋白的TST阳性符合率提高了18.49%;RCE一间接ELISA较CE一间接ELISA多检出阴性样本26份，比CE蛋白的TST阴性符合率提高了12.74%;说明RCE一间接ELISA较CE一间接ELISA具有更高的灵敏度与特异性。用RCE一胶体金试纸条检测301份牛血清，

8、与进口试纸条比较，阳性符合率达到97.78%(88/89)，阴性符合率达到95.91%(211/220)，总符合率为96.45%(299/310)。说明本研究中的RCE一胶体金试纸条与国际上同类产品具有相似的灵敏度和特异性。检测了468份鹿血清，R