提取分离的人参皂苷rg1对脂多糖诱导的小胶质细胞的炎症反应的影响

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1、重庆医科大学硕士学位论文提取分离的人参皂苷Rg1对脂多糖诱导的小胶质细胞的炎症反应的影响姓名：王乐乐申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：董志201205重庆医科大学硕士研究生学位论文提取分离的人参皂苷Rgl对脂多糖诱导的小胶质细胞的炎症反应的影响摘要目的本文旨在关注中药一一人参对脑缺血再灌注损伤时细胞炎症反应的改善。采用多种提取方法进行比较，通过条件优化选出简单，快速，准确，成本较低的方法，从人参中提取出人参皂苷R91。然后进一步研究提取后的人参皂苷R91对脑缺血再灌注时，小胶质细胞相关的因子的调节，以证实人参对脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法1首

2、先从重庆中药材市场上购买的中药人参，通过回流法和超声法提取人参总皂苷；然后使用硅胶柱层析法从人参总皂苷中进一步分离人参皂苷Rgl；最后利用购买的人参皂苷R91标准品，用高效液相法制作人参皂苷R91标准曲线，对提取出的人参皂苷Rgl进行含量测定。通过不同提取方法的比较以及对硅胶柱层析法的条件优化，选择出最优提取分离方案：超声法提取人参总皂苷，硅胶柱层析进一步分离人参皂苷R91，高效液相法进行含量测定。2将购买的小胶质细胞，通过传代培养，采用MTT法检测LPS和药物对BV2小胶质细胞生长活力的影响，最终确定最适宜的脂多糖气重庆医科大学硕士研究生学位论文和人

3、参皂苷R91的浓度。本实验共分为5组：①对照组，②脂多糖组，③药物组(a．人参皂苷R91终浓度为2．5IJm01／L，b．人参皂苷R91终浓度为5}Jm01／L，c．人参皂苷R91终浓度为10lJmol／L)。对照组为BV-2细胞常规培养；脂多糖组为BV-2细胞常规培养加脂多糖培养(脂多糖终浓度为0．1IJg／1nL)；药物组又分为BV-2细胞常规加a．人参皂苷R91终浓度为2．5IJmol／L．b．人参皂苷R91终浓度为5Umol／L；c．人参皂苷R91终浓度为10Umol／L，1h后，再加LPS培养(LPS终浓度为O．1Ug／mL)。处理12个小时

4、之后使用ELSA试剂盒，检测脂多糖诱导小胶质细胞后，细胞上清液中IL．1，NF．kB以及iNOS的表达量的变化。结果l本研究通过高效液相法制作人参皂苷标准曲线标准曲线的定量范围为3．5～一17．5I

5、g，相关系数R：为0．9994。采用硅胶柱层析分离合并的35g人参总皂苷，得到人参皂菅R919．9lg，纯度为89．63％。2第二部分采用MTT法检测LPS和人参皂苷R91对细胞活力的影响，最后选定诱导小胶质细胞的LPS浓度为0．1g／mL，加入的人参皂苷R91浓度选择2．5岬ol／L，5岬ol／L和lO岬ol／L。然后利用IL～1，NF—kB和一氧化氮合

6、酶试剂盒检测LPS诱导小胶质细胞活化后产生和表达的IL一1，NF—kB和iNOS。结果显示，(1)IL—l：与对照组比较，LPS组的IL～1含量显著升高(P<0。05)。与LPS组相比，不同浓度的人参皂苷R91作用BV一2细胞后，IL—l的表达量逐渐降低，与LPS组差距显著，其中人参皂苷Rgl浓度为2．5IJmol／L时，无统计学差异，4重庆医科大学硕士研兜生学位论文而与LPS相比人参皂苷R915lJm01／L组，P<0．05，人参皂苷R911OUmol／L组，P<0．01。说明人参皂苷R91预先处理细胞以后，能减少小胶质细胞的炎症因子IL—l的表达。

7、(2)iNOS：与对照组比较，LPS组的iNOS含量显著升高(P<0．01)。与LPS组比较，不同浓度的人参皂苷R91作用BV一2细胞后，iN0s的表达量逐渐降低，与LPS组差距显著。人参皂苷R912．5IJm01／L组和人参皂苷Rgl5Um。l／L组，P<0．05，人参皂苷R9110IJm01／L组，P<0．01。说明人参皂苷R91预先处理细胞以后，能减少小胶质细胞iNOS的表达。(3)NF-kB：与对照组相比，LPS组的NF—kB表达量明显升高(P<0．01)。与LPS组比较，不同浓度的人参皂苷Rgl作用BV一2细胞后，NF—kB的表达量逐渐降低，

8、与LPS组差距显著。人参皂苷R912．5IJm01／L组，人参皂苷Rgl5Umol／L组以及人参皂苷R9110¨m01／L组与LPS组比较NF—kB表达量明显降低(P

9、速，简便，成本较低，纯度基本符合要求。2采用MTT法检测LPs和人参皂苷R91对细胞活力的影响