基于等位基因特异性扩增-电化学传感技术检测肿瘤细胞braf基因v600e突变的方法学研究

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文基于等位基因特异性扩增．电化学传感技术检测肿瘤细胞BRAF基因V600E突变的方法学研究Enzyme—LinkedElectrochemicalAssayfortheDetectionofBRAFV600EAllele—specificPCRAmplicons课题来源：广东省自然科学基金($2011010003840)广东省科技计划重点项目(2010A030300006)专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员临床检验诊断学司徒博郑磊教授吴晓蔓教授李林教授温旺荣教授郑卫东主任技师曾方银主任技师论文评阅人王前教授邹

2、小勇教授2012年5月10日IlllllllIllIIIIlY2257267．基于等位基因特异性扩增．电化学传感技术检测肿瘤细胞BlUfF基因V600E突变的方法学研究硕士研究生：司徒博指导老师：郑磊教授摘要研究背景恶性肿瘤对人类的威胁日益突出，探求有效的早期诊断及治疗方法已成为当前医学领域中重大的研究课题，也是基础与临床医学研究的热点方向。肿瘤细胞在基因组水平上与正常体细胞存在巨大差异，在肿瘤演变及生长过程中被稳定复制的一些重要的驱动突变，可作为一种新的生物标志物，对肿瘤的诊断以及预后判断将提供重要信息。检测这类驱动突变的主要临床意义包括：1．通过从肿瘤患者

3、外周血及其他体液，或者穿刺组织中检出肿瘤源性的突变基因，提供早期诊断信息；2．监测患者治疗后(手术、放化疗)的肿瘤复发情况；3．根据肿瘤组织的突变信息进行分子分型，为疾病的预后、靶向药物的选择提供依据。BRAF基因编码蛋白是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen—activatedproteinkinases．MAPKs)通路中的一种丝／苏氨酸特异性激酶，是RAS依AF侏伍K／ERK瓜厦APK通路重要的转导因子。BRAF基因V600E是该基因的热点突变(约90％)，表现为T变为A，突变结果导致其编码的谷氨酸(glutamicacid)由缬氨酸(valine)取代(

4、V600E)。鉴于BRAF及MAPK通路对肿瘤发生发展的重要作用，BRAF基因的生物学行为和临床意义成了近年的研究热点。中文摘要研究结果显示，BRAFV600E突变是区分遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditarynonpolyposiscolorectalcancer,HNPCC)区分散发性结直肠癌的初筛指标之一。在结直肠癌患者的靶向治疗中发现，携带有BRAFV600E突变是患者对EGFR单抗药物(西妥昔单抗、帕尼单抗)的疗效不佳的生物学指标，同时也是预后不良的一个重要标志。在毛细胞白血病(Hairy．CellLeukemia)肿瘤细胞的测序发现，肿瘤细胞

5、全携带有BRAFV600E突变，这提示BRAFV600E很可能是毛细胞白血病致病的一个重要机制，同时也成为该病的一个新型的特异性诊断标志物，亦为该病BRAF靶向治疗提供新方向。临床试验显示，相对于传统抗恶性黑素瘤的药物氮烯咪胺，Vemurafenib(PLX4032)组在携有BRAFV600E的突变的晚期恶黑患者中显示出极佳的疗效，可大大提高晚期恶性黑色素瘤患者的反应率、无进展生存期与总生存期，被誉为近30年恶性黑素瘤治疗最大的研究突破。除此以外，在多种人类恶性肿瘤中，如肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的BRAF基因突变，这提示BRAF的分子分型不

6、仅可成为肿瘤诊断的生物标志物，同时亦可能作为今后这类肿瘤亚型靶向药物疗效预测的新标志。实体肿瘤细胞往往混杂于正常的体细胞中，这为突变基因的检测带来挑战，如何敏感特异地检测低水平的肿瘤突变基因，是临床实验诊断学发展的新要求。研究目的立足于低水平肿瘤突变基因的电化学检测方法研究，初步建立一种结直肠癌细胞BRAFV600E突变基因的检测方法。该方法主要结合等位基因特异性扩增及酶促反应电化学传感的原理，实现对较低水平肿瘤BRAFV600E突变基因的检测。通过与Sanger测序及琼脂糖电泳的方法比较，比较该方法的敏感性及特异性，为低水平肿瘤基因突变的电化学检测提供新思路

7、。研究方法II硕士学位论文1．利用等位基因特异性扩增技术检测人结直肠癌细胞系BRAF基因V600E突变1．1提取两株大肠腺癌SW480及HT29细胞的基因组DNA、设计引物扩增BRAF基因第15外显子，通过测序观察它们BRAF15外显子的突变情况。1．2根据人GeneBank公布序列及BRAFV600E突变位点，利用PrimerPremier5．0软件设计等位基因特异性扩增引物，优化条件后，分别对两株细胞系的DNA进行等位基因特异性扩增，琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。2．酶促电化学传感方法检测BRAFV600E等位基因特异性扩增产物2．1利用生物素化的dCTP搀

8、合至聚合链酶反应产物。探讨不同比例的b