与中国原产完全甜柿乙醇脱涩相关基因的筛选

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1、华中农业大学硕士学位论文与中国原产完全甜柿乙醇脱涩相关基因的筛选姓名：杨福勇申请学位级别：硕士专业：果树学指导教师：罗正荣201206与中国原产完全甜柿乙醇脱涩相关基因的筛选摘要中国原产完全甜柿(简称中国甜柿或C．PCNA)是在湖北省大别山区发现的完全甜柿种质资源，具有解决甜柿亲本稀少而造成的近交退化现象的应用潜力，但其遗传背景及脱涩机理尚不清楚。本研究以‘小果甜柿’(DiospyroskakiThunb．‘Xiaoguo—tianshi’)为试材，采用SSH(抑制消减杂交)技术筛选人工脱涩过程中差异表达基

2、因，以期为探讨其脱涩机理及其遗传改良提供进一步的科学依据。主要研究结果如下：1．本试验构建10％乙醇处理果实的正反向消减文库；正向文库随机挑选和保存1600个阳性克隆，反向文库随机挑选和保存1800个阳性克隆。2．本试验利用抗生素和菌液PCR等方法筛选文库阳性克隆；菌液PCR分析表明，克隆插入片段在300．1200bp之间，文库重组率为95％；正向文库随机挑选34个阳性克隆测序获得32条有效EST序列，反向文库挑选59个阳性克隆测序获得55条有效EST序列；剔除重复序列和小于100bp序列，两库序列合并组装

3、获得70条序列。利用BLAST进行非冗余(non．redundant)数据库序列相似性比对，其中53条序列有确切功能，根据其预测功能进行GO(geneontology)分类，其生物学功能有：转运活性(transporteractivity)2个、催化活性(catalyticactivity)22个、结构分子活性(structuralmoleculeactivity)3个、分子传感器活性(moleculattransduceractivity)1个和绑定活性(bindingactivity)24个。3．正向文

4、库获得8条与脱涩相关的EST序列，其中包括参与柿果实无氧条件下乙醇发酵代谢过程的两个关键酶一丙酮酸脱羧酶(pyruvatedecarboxylase，PDC)和乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，ADH)基因序列；另外六个编码的蛋白分别为NADH泛醌氧化还原酶亚基7(nadh．plastoquinoneoxidoreductasesubunit7，NQO)、甲酸脱氢酶(formatedehydrogenase，FDH)、跨膜超家族9成员4(transmembrane9superfamily

5、member4．1ike，TM9SF．4)、液泡巯基蛋白酶(thiolproteasealeurain)、细胞色素B还原酶(cytochromebreductase)和MYB转录因子(mybfamilytranscriptionfactor)。4．反向文库获得14条与脱涩相关的EST序列，编码的蛋白包括：S．腺苷甲硫氨酸合成酶(s．adenosylmethioninesynthetase，SAMS)；cop9信号小体复合体亚基5A(cop9signalosomecomplexsubunit5a—like)；

6、ring—box蛋白(ring—boxprotein，RBX)；cullin3蛋白(cullin3)；组蛋白h3(hi．oneh3)；双因子响应调节阀art11(two．componentresponseregulatorarrll)；组织蛋白酶b(cathepsinb)；过敏诱导响应蛋白(hypersensitive．inducedresponseprotein)；甘油醛．3．磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)：小分子热休克蛋(smal

7、lheatshockprotein)；核酮糖二磷酸羧化酶小链(ribulosebisphosphatecarboxylasesmallchain)；CC—nbs．1rr抗性蛋白(CC．ribs．1rrresistanceprotein)；蛋白．L．异天冬氨酸0一甲华中农业大学2012届硕士学位论文基转移酶(protein-L-isoaspartateo-methyltransferase)和kdaI类热休克蛋白(kdaclassiheatshockprotein)。综上所述，中国甜柿的脱涩过程与参与‘凝固效

8、应’的ADH和PDC有关，可能还包括转运等相关基因的表达。C．PCNA果实乙醇脱涩相关消减文库的构建为进一步研究打下了良好基础。关键词：中国原产完全甜柿；乙醇脱涩处理；抑制消减杂交；表达序列标签2AbstractChinesep011ination．constanta11dnon—astringent(C·PCNA)persimmon1sthenewPCNA田pe砌chfoundinDabieshanMontai