sums0382申克孢子丝菌生物学特性及免疫正常动物模型建立的初步研究

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1、中山大学硕士论文摘要SUMS0382申克孢子丝菌生物学特性及免疫正常动物模型建立的初步研究专业：皮肤病与性病学学位申请人：薛汝增指导老师：黄怀球副主任医师孢子丝菌病是一种皮肤、皮下组织及其附近淋巴系统的亚急性或慢性真菌感染，有时可波及各脏器。其致病菌申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii，简称&schenckiO广泛存在于自然界，尤其是热带和亚热带地区，中国亦为高发地区。S．schenckii的形态特征是与其它双相型真菌鉴别的重要依据，同时与其致病性关系密切。其在25℃生长状态为菌丝相，

2、表现为淡褐色至深褐色或黑色菌落，有皱褶或沟纹，可见灰白色短绒毛状菌丝，镜下可见纤细分支分隔菌丝，生孢子梗位于菌丝两侧直角长出，呈梅花朵样或“套袖”状排列；37℃为酵母相，表现为白色至灰黄色酵母样菌落，镜下可见圆形、长形或者梭形孢子，有出芽。双相型转化是S．schenckii的重要特征之一，转化条件较复杂，存在菌株特异性，并且与菌株的毒力相关。Sschenckii侵入宿主后，通过一系列的形态学改变来适应宿主的内环境，造成组织损伤，抵抗宿主免疫杀伤。目前大多数学者认为酵母相是Sschenckif的致病形态

3、。孢子丝菌病呈慢性病程，发病部位皮肤组织纤维化导致其治疗周期长，费用高，而且已有对两性霉素B治疗失败的报道，亦有对伊曲康唑MIC值较高的报道，因此有必要进行体外药敏试验及耐药菌株的临床监测。《美国传染病协会2007版孢子丝菌病临床治疗指南》推荐，伊曲康唑作为非系统性孢子丝菌病的首选单独治疗药物，很多学者亦尝试了联合治疗，并取得一定疗效。而与之相关的体外药敏试验仍处于探索阶段，由于影响因素较多，哪一种生长形态的药敏试验结果更为准确可靠、并用以指导该病治疗尚存争议。目前尚无S．schenckii对伊中山大

4、学硕士论文摘要曲康唑耐药的报道，亦无相关药敏试验耐药标准的报道，对其耐药机制需进一步探讨。尽管很多学者通过建立动物模型的方式，对Sschenckii的致病性、宿主免疫反应及治疗方面进行了探讨，但迄今为止仍未有明确的阐述。动物模型的建立是由宿主和受试菌株共同决定的，影响因素较多，既往文献报道动物模型多是在免疫抑制基础上建立的，既不能反应疾病的自然进程，也不能反应宿主的正常免疫作用。因此建立理想的孢子丝菌菌病动物模型，模拟自然发病过程，对该疾病发病机制的阐明及治疗药物的疗效评价具有重要意义。本课题拟通过对

5、分离自l例伊曲康唑治疗失败的孢子丝菌病患者的临床菌株SUMS0382的生物学特性及所建立的相应慢性皮肤感染动物模型进行研究，有助于阐述S．schenckii的致病性。第一部分SUMS0382申克孢子丝菌的生物学特性研究目的探讨SUMS0382申克孢子丝菌的酵母相转化条件、生长抑制温度及体外药敏试验，进一步明确其真菌生物学特性。方法l、酵母相转化。将实验菌株传代活化2次后，超净工作台内，挑取生长良好的菌落团块，采用划线接种法，接种于BHIA+5％羊血斜面试管和BHIA+o．5％GS斜面试管，各2管，置C

6、02恒温温箱35"C培养。必要时连续传代，直至转化成功，获得灰白色酵母型菌落。2、温度生长抑制试验。将酵母相实验菌株，采用划线接种法，接种于SDA平板、PDA平板、BHIA平板、BHIA+5％羊血平板和BHIA+O．5％GS平板，各2个，分别置35℃、36"C、37"C和38"CC02恒温温箱培养14d，观察各菌株生长情况，记录各实验菌株的停止生长温度。3、伊曲康唑和特比萘芬体外联合药敏试验。活化菌株，分别制备菌丝相和酵母相菌悬液，菌丝相浓度调整至5×104CFU／mi(2倍终浓度)，酵母相调整至2．

7、5x103CFU，ml(2倍终浓度)；采用微量液基稀释法加样制板后，菌丝相置25℃，酵母相置35℃孵育，第5d观察结果。结果判断标准为各药的MIC终点II中山大学硕：{：论文摘要为100％生长抑制，联合用药效果评价采用分数抑菌浓度指数评价。4株菌均进行3次重复试验。结果l、通过连续传代，成功获取4株申克孢子丝菌的酵母相。2、SUMS0382、BMU02035和SUMS0383在35℃和37℃生长较好，36℃生长差，38℃时停止生长，BMU0047i均生长良好。3、体外联合药敏试验显示伊曲康唑和特比萘芬

8、不论单独应用还是联合应用，菌丝相GM值均高于酵母相；两药相互作用结果显示：菌丝相时，SUMS0383和BMU0047l显示相加作用，SUMS0382和BMU02035显示无关作用；酵母相时，SUMS0382、SLMS0383和BMU02035显示相加作用，BMU0047l表现为无关作用。结论l、该菌株酵母相转化需要富含营养的培养基，连续传代，35℃是适宜温度。2、菌株SUMS0382的生长抑制温度为38℃。3、生长时相对S．schenckiiMIC值有明