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1、Vol.23高等学校化学学报No.62002年6月CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES1044～1046[研究简报]压电免疫传感器用于乙肝表面抗原的测定112112陈泽忠,王柯敏,陈永康,肖丹,羊小海,邵国强(1.化学生物传感与计量学国家重点实验室,湖南大学化学化工学院,长沙410082;2.香港浸会大学化学系,香港)关键词压电免疫传感器;乙肝表面抗原;自组装膜中图分类号O657文献标识码A文章编号025120790(2002)0621044203乙肝表面抗原(HBsAg)的检测是临床诊断乙型肝炎的一项重要指标.目前常用酶联免疫法和放射[1]免疫法检测,但酶
2、本身性质不稳定且价格昂贵、操作繁琐;而放射免疫法存在放射性废物难处理的局限性.压电免疫传感器具有装置简单、价格便宜、灵敏度高、实时快速和无需标记等优点,广泛应用[2～4]于环境监测、药物分析及微生物检测等多个领域.本文应用自组装单分子膜技术,在压电石英晶体表面形成致密有序的半胱胺单分子膜,通过戊二醛共价交联,将乙肝表面抗原单克隆抗体分子固定于晶体电极表面,研制成HBsAg压电免疫传感器,用于定量测定HBsAg溶液和区分乙肝表面抗原阴性和阳性对照血清.1实验部分1.1试剂与仪器纯化的乙肝表面抗原溶液(211mgömL),使用前经0101molöL的PBS稀释至115mgömL,纯化的乙肝表面抗原
3、单克隆抗体(819mgömL)(武汉市生物技术研究开发中心);乙肝表面抗原酶标测定试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司);胱胺盐酸盐(Aldrich公司);戊二醛(武汉有机合成化工厂);D,L2赖氨酸单盐酸盐(中国科学院上海生物化学研究所);甘氨酸(上海康达氨基酸厂);其它试剂均为分析纯,水为二次蒸馏水.SP3165型等精度频率计数器(南京盛普电子实业有限公司);压电石英晶体(北京707厂):AT切割型(JA5型),9MHz,双面镀金,晶片直径14mm,电极直径8mm;振荡电路为自制TTL电路,为了使石英晶体在溶液中稳定振荡,石英晶体的其中一个面用O[5]形橡胶圈和塑料薄片通过硅橡胶封闭,形成单面
4、触液;自制反应池(体积约3mL).1.2抗体的固定在石英晶体未封闭的金电极表面滴加一滴Piranha溶液(浓H2SO4和30%的H2O2的混合溶液,体积比为3∶1),放置3min后,用水清洗,重复3次,将洗涤后的石英晶体置于0102molöL胱胺溶液中于室温下浸泡2h,经洗涤后转入5%戊二醛(体积分数)溶液中浸泡1h,清洗晾干后,滴加25LL乙肝表面抗原单克隆抗体溶液,放置1h,洗涤后,置于012molöL赖氨酸溶液中浸泡30min,封闭残余醛基.洗涤晾干,将修饰抗体的石英晶体置于4℃冰箱中保存备用.1.3检测方法将已修饰抗体的晶体插于反应池的凹槽中,加入310mL0101molöL磷酸盐缓冲
5、液(PBS),待频率趋于稳定后($f≤1Hzömin),用微量注射器移取20LL115mgömLHBsAg溶液,缓慢注入反应池中.待反应50min后,记录其频率变化.整个实验均在室温(20℃)和搅拌下进行.1.4石英晶体的再生对已使用过的石英晶体,用Piranha溶液处理,再分别以011molöLHCl、丙酮和水超声清洗后晾干,贮存于干燥器中备用.2结果与讨论2.1抗体固定过程的监测将石英晶体浸入胱胺溶液后,胱胺分子与石英晶体表面的金原子作用,收稿日期:2001203206.基金项目:TheResearchGrantsCounciloftheHongKongSpecialAdministrat
6、ionRegion,China(No.HKBU2054ö98p),国家杰出青年基金(批准号:29825110)及湖南省自然科学基金(批准号:00GKY1010)资助.联系人简介:王柯敏(1957年出生),男,教授,博士生导师,从事化学传感器及纳米尺度上获取生物化学信息的研究.No.6陈泽忠等:压电免疫传感器用于乙肝表面抗原的测定1045[6]形成半胱胺自组装膜(SAMs),膜表面的氨基与抗体分子末端的氨基分别与戊二醛的两个醛基作用形成Schiff碱,从而将抗体分子共价固定于晶体表面.监测结果表明,随着石英晶体表面依次固定胱胺与戊二醛,交联抗体,封闭残余醛基的进行,晶体表面吸附物质的质量增加,频
7、率下降,传感器响应的频移值($f)分别为(265±22)Hz,(175±13)Hz和(44±6)Hz.2.2抗体固定的适宜浓度实验考察了固定时抗体浓度的影响.将抗体用0101molöLPBS作不同比例稀释,再通过戊二醛共价交联60min,使其固定于晶体表面.结果表明,$f随抗体浓度的增大而增大,当抗体浓度为210mgömL时,$f达到最大值,抗体浓度更大,$f基本不变(见图1).表明此浓度下,晶体
