分子诊断在肿瘤诊断及个体化

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1、分子诊断在肿瘤诊断及个体化治疗中的应用与进展叶建伟吴阶平医学基金会分子医学中心肿瘤分子诊断策略&检测平台的综合应用肿瘤/个体相关基因变异染色体水平改变DNA局部变异RNA表达水平差异蛋白质表达差异FISH未知突变已知突变实时定量PCR等IHC/ELISA广泛分布局部突变>20%低含量DHPLC测序实时荧光PCR等多层次检测平台的综合应用分子生物学技术ClinicalCancerResearch2007;13(17):4954-5其他分子生物学技术：DHPLC+后荧光、突变富集PCR+DHPLC后荧光、突变富集PCR+RFLP+DHPLC后荧光、突变富集PCR+直接测序…

2、…细胞生物学技术：FISH、FACS蛋白质组学技术：IHC、ELISA、蛋白质指纹图谱不同检测水平的综合应用中心法则：DNARNA蛋白质经典检测方法与结果示例直接测序•DNA提取•PCR扩增•测序EGFRexon19c.2231del(CAAGGAATTAAGAGAAGC)18bp•优势：直接获取已知/未知DNA突变信息，准确可靠。金标准！•局限性：检测肿瘤组织的DNA变异时，最高灵敏度为20%。•适用范围：个体遗传学背景检测大部分肿瘤组织、体液中肿瘤脱落细胞DNA变异检测实时荧光PCRCCDNA提取TReal‐timePCR扩增优势：快速，防污染，灵敏度极高，结果准确

3、可靠。局限性：仅针对已知变异。适用范围：个体遗传学背景检测肿瘤组织、体液中肿瘤脱落细胞、外周血游离肿瘤DNA变异测突变富集PCR+DHPLCC血浆游离肿瘤DNA提取穿刺活检组织DNA提取突变富集PCRDHPLC（+后荧光）优势：高度灵敏（1/1000~1/10000），快速，结果准确。局限性：仅针对已知变异。适用范围：低含量肿瘤DNA变异监测实时定量PCRFFPE中mRNA提取反转录荧光定量PCR技术优势：快速，通量大，结果准确可靠。局限性：样本处理及保存要求高。适用范围：肿瘤组织中特定基因mRNA表达水平IHC石蜡包埋制片免疫组化（IHC）乳腺癌：C-erbB2（++

4、+）技术优势：快速，直观。局限性：主观因素干扰，抗体来源限制。适用范围：检测肿瘤组织相关蛋白质水平变化ELISA抽取外周血酶联免疫吸附试验（ELISA）技术优势：快速，方便。局限性：主观因素干扰，灵敏度受限。适用范围：检测血清中肿瘤组织分泌的蛋白标记物FluorescenceInSituHybridization一项快速、准确、高灵敏度的细胞‐分子生物学技术在恶性肿瘤相关基因/染色体区域的大片段缺失、扩增、转位等方面具有重要诊断价值是常规分子诊断技术的重要补充HERHER--22扩增扩增//过表达过表达:FISH:FISHNormalbreastcellsCanc

5、erbreastcellsGreenprobe:chromosome17centromereRedprobe:HER2/NEUgenelocusDHPLC在分子诊断中的应用DHPLC突变检测原理后荧光技术WAVE-HSDHPLCAnalysisDirectSequencingWild‐typeControlHeteroduplexesC/T50%C/T20%2%0.5%基因芯片在肿瘤分子诊断中的应用•DNA芯片：遗传易感性（P450）•表达谱芯片：肿瘤预后和复发评估（乳腺癌）Stanford乳腺癌微矩阵(Perouetal.1999)其他新技术与进展•全基因组水平/未知

6、基因的系统发现：高通量测序•Solexa、SOLiD和Roche454、单分子测序等•应用：–全基因组重测序：诊断、药物敏感性/毒性预测–肿瘤RNASeq：基因表达分析–肿瘤基因组计划：病因学研究其他新技术与进展•待测基因的深度分析：低含量突变检测技术–突变富集–COLD-PCR–SMAP•检测平台的扩展与延伸：分支DNA检测平台–液相芯片检测系统–Panomics/Affymetrix检测试剂盒–RNAscope™：mRNA原位表达检测技术针对不同来源标本的系统解决方案•石蜡标本–DNA提取：肿瘤组织体细胞突变（测序、实时荧光PCR）–RNA提取：肿瘤组织RNA表达异

7、常（荧光定量PCR）–石蜡切片：染色体水平异常（FISH）–石蜡切片：蛋白质表达差异（IHC）•新鲜肿瘤（来源）标本–肿瘤组织穿刺标本：肿瘤组织体细胞突变（突变富集PCR+DHPLC）–胸、腹水：肿瘤组织体细胞突变（突变富集PCR+DHPLC）•外周血–PMBC：个体基因多态性（PCR+测序、实时荧光PCR）–血浆游离DNA：肿瘤早期诊断、治疗检测（突变富集PCR+DHPLC）–血清：肿瘤标志物（ELISA、蛋白质指纹图谱）谢谢！