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1、华中科技大学博士学位论文SEC-10在线虫细胞转运途径中的功能研究姓名：章雷申请学位级别：博士专业：生物物理学指导教师：徐涛20090520华中科技大学博士学位论文*摘要Exocyst复合物是由SEC-3,SEC-5,SEC-6,SEC-8,SEC-10,SEC-15,EXO-70和EXO-84共8种亚基蛋白组成一种蛋白质复合物，它在细胞内物质的转运中起着重要的作用。目前人们认为exocyst复合物主要作用于囊泡和膜结构融合之前的栓系（tethering）过程，以及囊泡从高尔基体分泌之后被转运到膜附近的过程，但是对于其具体分子机制尚无法完全阐明。此外还有报道e
2、xocyst复合物的蛋白组分SEC-5，SEC-8在胞吞中行使功能。为了更加清晰的了解exocyst复合物的作用机理，以及探寻该复合物是否还存在其他未知的功能，我们针对exocyst复合物的蛋白组分SEC-10开展了研究。线虫作为模式生物在诸多方面存在着不可比拟的优势，所以我们选取它作为研究的平台。我们首先构建完成了国内首个高通量线虫突变基因库，通过对该突变基因库进行筛选，我们成功得到sec-10基因突变的线虫种系。我们发现sec-10基因的缺失引起了线虫的多种缺陷表型，而且sec-10基因也广泛地在线虫体内表达。我们分别针对了神经肌肉接头处的信号传递，腔胞的
3、胞吞以及产卵这三个方面进行了研究。神经肌肉接头处的电生理数据显示sec-10基因的缺失对于目前已经报道过的突触后三种离子型受体均不存在影响，而且也未干扰突触前的囊泡自发性分泌。但是药学实验的结果却能够推论出sec-10基因突变种系的突触后膜上受体过度敏感，我们推测是由于突触后膜上离子型受体以外的其他类型受体受到了影响。通过GFP吸收实验，我们发现sec-10基因突变种系的腔胞存在明显的胞吞缺陷，而肌肉分泌GFP完全正常，成像结果显示sec-10基因的缺失严重影响了Clathrin依赖的胞吞途径相关分子的定位和形态，但是sec-10基因突变种系的腔胞中早期内涵体
4、，晚期内涵体，溶酶体以及高尔基体的形态和分布均正常，而且rhodamin-dextran在胞内的定位也和野生型基本一致，因此推测该突变体Clathrin依赖的胞吞途径受阻，而腔胞内转运过程未产生明显改变。最后对于产卵过程中若干关键步骤的检测结果显*本研究课题得到科技部国家重大科学研究计划蛋白质专项（No.2007CB914200），973计划项目（No.2006CB503900,2006CB910700）资助。I华中科技大学博士学位论文示，sec-10基因突变种系的肠部分泌卵黄完全正常，而卵母细胞对卵黄的吸收异常，卵黄是受精卵发育过程中的必需营养成分，推测se
5、c-10基因突变种系的受精卵在后继发育过程中养分不足，可能导致产卵障碍。关键词：sec-10，exocyst复合物，线虫，神经肌肉接头，腔胞，产卵II华中科技大学博士学位论文*AbstractExocystcomplex,whichiscomposedofSEC-3,SEC-5,SEC-6,SEC-8,SEC-10,SEC-15,EXO-70andEXO-84,playsanimportantroleintheintracellulartransport.Todate,itismainlyconsideredthatexocystcomplexfunction
6、sinthetertheringprocessandthetransportfromGolgiapparatustoplasmamembrane.However,themechanismstillneedstobeuncovered.Besides,itisalsoreportedthatSEC-5andSEC-8mayalsofunctionintheendocytosis.Inordertoclarifythemechanismandfindoutifthereareotherpathwayswhichexocystcomplexmayinvolvein,
7、westudytheSEC-10.C.elegans,apowerfulmodelorganism,haslotsofadvantages,sowechooseittobeourresearchplatform.First,weconstructaworm-mutantlibrary,whichisthefirstoneinChina.Afterscreeningthelibrary,weobtainthesec-10geneknockoutmutant.Thesec-10geneknockoutinducesalotofdefectivephenotypes
8、,andwefindthatthese
