桔小实蝇几丁质合成通路上3个基因cdna克隆和功能地分析

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1、西南大学硕士学位论文5．4小结与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯515，4．1小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．515．4．2讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51第六章不同发育阶段及饥饿饲喂后中肠几丁质含量测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯536．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯536．1。l供试虫源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯536．1．2供试试剂及主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一536．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯536．2．1桔小实蝇幼虫饥饿饲喂及中肠解剖冻存⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．536．2．2桔小实蝇不同发育阶段虫源收集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯：⋯⋯⋯⋯⋯．．546．2．3几丁质含量测定方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．546．3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯566．3．1几丁质含量测定中葡萄糖胺标准曲线的制作⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。．566．3．2桔小实蝇饥饿．饲喂后中肠几丁质含量的测定⋯⋯

3、⋯。⋯⋯⋯⋯⋯．．．576．3．3桔小实蝇不同发育阶段几丁质含量的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．586．4小结与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯596。4．1小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯596．4．2讨j沦⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59主要结果、结论与展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．611．结果和结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯612．展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．63攻读学位期问取得的研究成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。73致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯75中文摘要摘要桔小实蝇Bactroceradorsalis(Hendel)隶属于双翅目(Diptera)，实蝇科(Tetrphitidae)，果实蝇属(Bactroceramacpuart)，寄主范围广，是为害多种水果和蔬菜的世界性害虫。自传入我国以来，迅速扩散至广

5、东、广西、台湾等沿海地区，近年来自南向北继续扩散至江苏、浙江、湖北等省市。桔小实蝇主要通过幼虫在果实内部危害，导致瓜果腐烂、脱落，而造成巨大的经济损失。这种特殊的危害方式导致幼虫的危害在早期难以被发现，而传统的化学防治也难以达到防控的目的。昆虫生长调节剂以其环保且对人畜无害等优点成为研究的热点，它的作用靶标较多，几丁质就是其中之一。几丁质广泛存在于节肢动物、线虫、酵母等非哺乳动物体内，由于其存在的特殊性而引起研究者们的广泛兴趣——作为害虫防治的靶标研发新型环保农药等生物制剂，从而达到田间防控害虫的目的。几丁质的合成是一个

6、复杂的过程，至少需要8种酶的共同参与，其中某一个过程受阻就会导致几丁质的合成受阻，导致昆虫因缺少几丁质而不能存活。本学位论文针对参与几丁质合成通路上的3个重要的酶(几丁质合成酶2，Chitinsynthase2：葡萄糖．6．磷酸异构酶，Glucose．6．phosphateisomerase；UDP—N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶，UDP-N-acetylglucosaminepyrophosphorylase)，通过分子克隆，定量表达，饥饿饲喂，几丁质含量测定，抑制剂生物测定等方法，对桔小实蝇这3个基因的分子生物学特性进行了

7、初步的研究，主要结果如下：1．桔小实蝇几丁质合成通路上BdCHS2、BdG6PI和BdUAP基因的cDNA全长克隆及序列分析从本实验室测序获得的桔小实蝇转录组中获取相应的Unigene片段，通过Overlapping技术获得cDNA大片段，然后结合cDNA末端快速扩增(rapidamplificationofcDNAends，RACE)技术，成功地从桔小实蝇体内分离克隆获得3个几丁质合成通路上的基因BdCHS2、BdG6PI和BdUAP的cDNA全长序列，GenBank登录号分别为KC354694、JQ925874及JX

8、434756。通过序列分析，明确了这3个通路基因的开放阅读框，并推导了其编码的氨基酸序列。进一步利用相应的软件预测蛋白质的理化性质、保守基序、跨膜结构等生理功能。另外，从NCBI上下载其他物种相应基因的eDNA序列，借助Mega5．04软件并应用NeighborJoining方法构建相对应的系统发育树，进一步明确与其