苹果g蛋白偶联受体mdgcr1基因的克隆及遗传转化 毕业论文

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1、山東農業大學学士学位论文苹果G蛋白偶联受体MdGCR1基因的克隆及遗传转化CloningandgenetictransformationofMdGCR1geneofappleGproteincoupledreceptor学生姓名：专业班级：2012级园艺五班学号：20125772学院：园艺学院指导教师：2016年5月29日目录中文摘要11前言12材料与方法22.1.1植物材料及仪器22.1.2菌株及载体22.1.3培养基22.1.4酶、试剂32.1.5引物32.1.6溶液和缓冲液32.2试验方法42.2.1CTAB法提取RNA

2、42.2.2Trizol法提取RNA42.2.3RNA含量与纯度检测52.2.4植物RNA纯化（除DNA）方法52.2.5反转录cDNA第一链的合成62.2.6基因扩增62.2.7PCR产物的回收62.2.8连接反应62.2.9大肠杆菌感受态细胞的转化72.2.10农杆菌感受态细胞的制备72.2.11电击法转化农杆菌72.2.12质粒DNA的提取82.2.13质粒DNA的酶切82.2.14表达载体的构建92.2.15转化烟草92.2.16植物基因组DNA的提取102.2.17基因组DNA含量与纯度检测103结果与分析103.1

3、苹果MdGCR1基因的克隆及进化树分析113.2MdGCR1的表达分析113.3苹果MdGCR1基因植物过表达载体的构建及获得转基因烟草124讨论135参考文献146致谢15中文摘要以‘嘎啦’（Gala）苹果为材料，采用同源克隆和PCR技术分离得到苹果G蛋白偶联受体基因MdGCR1。系统进化树分析显示，苹果MdGCR1与梨GCR1亲缘关系最近，同源性最高。基因表达分析显示MdGCR1主要在根、茎和叶中表达，在花和果实中的表达量相对较低；构建了MdGCR1植物过表达载体，并通过农杆菌介导的遗传转化获得了转MdGCR1基因的烟草过

4、表达株系。这为深入揭示G蛋白偶联受体基因在植物逆境响应过程中的作用机制提供技术基础。关键词：苹果；G蛋白偶联受体；MdGCR11前言G蛋白（Gprotein）全称为GTP结合调节蛋白（GTPbindingregulatoryprotein），又称偶联蛋白或信号转换蛋白,在细胞膜上受体接受胞外信号与膜内侧效应酶产生产生胞内信号之间，在信号传导中起着重要作用（Jietal.,1998;Burgetal.,2015）。G蛋白偶联受体（Gprotein-coupledreceptors,GPCRs）能感应胞外信号并将信号传递给G蛋白，

5、后者又将信号传递到下游相应的效应器（Albertandrobillard,2002;郭志云等，2004）。植物GPCRs介导的G蛋白信号转导途径是一种非常保守的信号机制，在植物生长发育中发挥重要作用（Jacobyetal.,2006）。GPCRs广泛存在于真核生物中，是已知最大的一类细胞表面受体（Leeetal.,2001;Pinetal.,2003）。GPCRs种类很多，但具有相似的蛋白结构，通常都是一条包含7个跨膜结构域的多肽链（Liebmannetal.,2004）。其肽链由N末端和C末端组成。N末端在细胞外，包含有7个

6、跨膜α螺旋，反复穿过细胞膜的脂双层，常常被糖基化修饰；C末端在细胞内，有3个胞外环和3-4个胞内环组成，常常发生磷酸化修饰（Pinetal.,2003）。G蛋白偶联的信号传导系统由G蛋白偶联受体GPCRs、异三聚体G蛋白（αβγ三亚基）和效应器组成。当植物受到外界刺激时，细胞膜上的GPCRs受体与信号分子结合并活化，促使Gα-GDP转换成Gα-GTP，同时使异源三聚体-G蛋白复合体解离，通过Gα、Gβ或者Gβγ将信号传递给下游的效应器，最终引起一系列的生理生化应答反应（Uranoetal.,2013）。研究表明，GPCRs能够

7、参与植物激素和抗逆反应，并在多种发育过程中发挥调节作用。Dymock等（1998）首先发现拟南芥GCR1基因失活将导致植株的根、茎对细胞分裂素不敏感，根、子叶和叶片的伸展受到抑制。Pandey和Assmann（2004）证明GCR1与GPA1偶联，调控ABA信号通路。最近，又有报道表明，拟南芥GCR1参与多种生物和非生物胁迫响应，并在磷酸盐饥饿响应中发挥重要作用（Chakrabortyetal.,2015）。水稻GPCRs研究较少，研究显示，编码G蛋白亚基的基因突变会导致植株矮化（Okietal.,200919），周宇科等（2

8、011）也证明超量表达水稻OsGPCR的植株对赤霉素反应更敏感。这些研究结果表明G蛋白偶联受体在植物生长发育、激素应答以及抗逆反应中发挥关键作用，但是G蛋白偶联受体的作用机制仍不清楚（TempleandJones,2007;TrusovandBotella,2012）。目前G