狂犬病病毒rsrv9减毒株口服脂质体冻干活疫苗的研究及免疫效价的测定

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1、分类号：S852.31学校代码：10758密级：公开学号：09020264硕士学位论文狂犬病病毒rSRV9减毒株口服脂质体冻干活疫苗的研究及免疫效价的测定Studyonoralliposomesfreeze-driedlivevaccinesofrSRV9attenuatedstrainanditsimmunepotencydetermination研究生姓名翟少华导师姓名及职称简子健学位门类级别农学硕士专业名称基础兽医学研究方向分子病理学所在学院动物医学学院新疆·乌鲁木齐二○一二年六月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个

2、人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其它教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文被

3、查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日I本文是新疆维吾尔自治区高新技术发展项目“动物用狂犬病口服疫苗研制”的部分研究成果（项目编号：200611107）课题主持人：简子健教授（新疆农业大学）I狂犬病病毒rSRV9减毒株口服脂质体冻干活疫苗的研究及免疫效价的测定摘要通过RT-PCR方法，鉴定了狂犬病病毒rSRV9减毒株与亲本SRV9毒株的基因组结构差异性区别

4、，扩增出了rSRV9减毒株基因组中插入的cytoc基因（369bp）。对连续培养的30代亲本SRV9病毒和拯救rSRV9病毒的病毒滴度和毒力的测定结果显示，亲本SRV9毒株与rSRV9减毒株的平均病毒滴度相差0.65logFFD50/0.1mL（P＜0.01），表明通过反向遗传学技术进行基因减毒修饰的rSRV9减毒株具有与亲本SRV9毒株相似的细胞内增殖能力。亲本SRV9毒株和rSRV9减毒株平均病毒毒力相比降低2.99logLD50/0.03mL（P＜0.01），表明狂犬病rSRV9减毒株与亲本SRV9毒株相比毒力减弱。

5、通过病理组织学和免疫组织化学检测出脑内注射亲本SRV9毒株和rSRV9减毒株死亡乳鼠脑神经细胞内的特异性Negri小体，表明脑内注射亲本SRV9毒株和rSRV9减毒株对乳鼠具有致病性。本实验采用薄膜分散法以氢化大豆卵磷脂、胆固醇、有机胺等物质为原料制备阳离子空白脂质体，再采用冻干技术将阳离子空白脂质体与rSRV9病毒等体积混合，加入冻干保护剂进行冻干，制成脂质体包裹狂犬病冻干口服活疫苗。通过电子显微镜观察到制备的空白脂质体形态为大单室脂质体，通过MASTER2000激光粒度仪检测空白脂质体平均粒径378nm，通过BCA蛋白

6、定量法测定疫苗的抗原包封率为71.19%。本试验将狂犬病减毒脂质体口服冻干活疫苗，按不同免疫剂量、不同免疫次数和不同免疫方式，免疫平均体重25g小鼠。通过双抗夹心ELISA方法和MTT法，分别对免疫后1~7周的免疫小鼠口腔粘膜分泌型SIgA、血清狂犬病特异性IgG和脾脏淋巴细胞转化率进行检测。口服免疫3次，免疫剂量1.0mL，免疫后35d，小鼠SIgA抗体产生水平为38.63μg/mL，小鼠血清狂犬病特异性IgG含量为18.70ng/mL；脾脏淋巴细胞转化增殖OD值为1.86，免疫效果较好。最终确定了狂犬病减毒脂质体口服冻

7、干活疫苗免疫小鼠最佳免疫剂量1.0mL（7.4logFFD50/0.1mL）；最佳免疫次数3次(第1天首次免疫、第7、14天加强免疫)。关键词：狂犬病病毒；rSRV9；脂质体；口服；疫苗；免疫效价IIStudyonoralliposomesfreeze-driedlivevaccinesofrSRV9attenuatedstrainanditsimmunepotencydeterminationAbstractThereweresomedifferencesidentifiedinthegenomestructureofR

8、abiesvirusbetweenrSRV9attenuatedstrainandparentstrainusingRT-PCRmethod,cytocgenes(369bp)insertedinthegenomeofrSRV9attenuatedstrainwereamplified.For30-ge