狂犬病免疫球蛋白效价测定课件

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1、狂犬病免疫球蛋白效价测定（小鼠法）贵州泰邦生物制品有限公司质量管理部：姜志文实验步骤一、狂犬病毒的传代二、狂犬病毒CVS的制备三、病毒的保存四、中和实验技术五、中和实验的影响因素六、实验体会一、狂犬病毒的传代从中检所购买冻干CVS毒株后，取其制成10-2悬液，脑内攻击小鼠0.03ml/只，每只小鼠10～12g，待发病后取脑再制成10-2悬液，攻击小鼠脑内进行传代，传至2～3代后选用第5天发病并麻痹的小鼠取脑制成-70℃冻存的中和用毒种。二、狂犬病毒CVS的制备启开毒种，稀释成10-2悬液，接种10～12g小鼠0.03ml/只，不少于10只，每只脑内攻

2、击传代，选择攻击4～5天有典型狂犬病症状的小鼠脑组织，研磨后加入2%或20%小牛血清PBS制成悬液（每只鼠脑加3ml），经2000转离心沉淀20分钟后，取上清液经病毒制成10-1滴定毒力和无菌检查符合规定后分装0.5ml/支作攻击病毒用。1、小鼠脑组织的获取⑴取鼠脑前的准备：a先用自来水多次冲洗小鼠，去掉身上脏物。用新洁尔灭消毒液浸泡换洗小鼠，3—5分钟。b操作用(解剖钳、手术刀、剪刀、镊子、平皿)，用蒸馏水煮开10—15分钟后将水到掉，经高压后用。（2）取脑步骤：a将小鼠放在平皿上，一手用镊子固定小鼠，一手拿剪子从颅部到咀部的皮肤完全切开，同时去掉

3、耳朵和上眼睑。b左手用镊子固定住小鼠的咀部并用手术剪开脑腔，首先切开从眼窝到中线，自颅顶骨到两侧。C用干净的镊子或剪刀切取脑前部无脑膜的脑组织，然后切取大脑髓质，将其置于研钵中。取脑过程中须是无菌操作。二、狂犬病毒CVS的制备2病毒悬液毒力的预测：-70℃冻存病毒的预测：取分装好脑悬液的冰冻病毒融化后即为10-1悬液，然后再稀释至10-2～10-7。从10-7至10-3各取0.5ml加至5个小管内,每管再加入小牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml，置37℃水浴1小时。二、狂犬病毒CVS的制备用体重10～12g小鼠30只，分成5组，每组6只，用经37℃作用的1

4、0-7至10-3病毒悬液接种小鼠，每个稀释度接种小鼠6只，每只小鼠脑内接种0.03ml,每天观察小鼠发病死亡情况，观察14天。接种后4天内死亡的小鼠按非特异性死亡计。以接种5天后的发病死亡小鼠统计LD50。三、病毒的保存将第5天发病并麻痹的小鼠脑用2%或20%的小牛血清PBS研磨稀释至10-1悬液，经2000转20min离心沉淀，取上清液混匀分装0.5ml/支小管，存-70℃冰柜待用。四、中和实验技术1磷酸盐缓冲液（PBS）制备：称取磷酸二氢钾0.24g、磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）1.44g、氯化钠8.0g、加注射用水溶解并稀释至100

5、0ml，用氢氧化钠调pH至7.6。灭菌后pH值应为7.2～8.0。四、中和实验技术a2%新生牛血清磷酸盐缓冲液：量取PBS98ml中，加入2ml灭能新生牛血清，临用前配制。B20%小牛血清磷酸盐缓冲液：量取PBS80ml中，加入20ml灭能新生牛血清，临用前配制。四、中和实验技术2病毒悬液LD50的预测取分装好狂犬病毒悬液一支以10倍递次稀释法稀释成不同稀释度。10-110-210-310-410-510-610-70.2ml+1.8ml病毒悬液0.2ml+1.8ml0.2ml+1.8ml0.2ml+1.8ml0.2ml+1.8ml0.2ml+1.8

6、ml四、中和实验技术3中和用病毒悬液的制备:A按病毒的悬液预测的结果计算LD50，将用其150个LD50的病毒稀释度作为中和用病毒悬液的稀释倍数。B举例：CVS毒力为10-6个logLD50,即病毒的LD50为6的反对数，如本次攻击病毒选100个LD50,即病毒的LD50为2，则6-2=4.即作10-4倍稀释。四、中和实验技术但在孵育时毒力会下降0.3-0.5个滴度，因此实验时把下降滴度加进。=>4+0.5=4.5最后做10-4.5倍稀释。四、中和实验技术4供试品溶液的制备:用PBS将供试品做2倍稀释,供试品取0.3ml加2.7ml稀释液制成1:10

7、溶液,再取1:10溶液0.3ml加入2.7ml稀释液制成1:100溶液,再按稀释液0.5ml加0.5ml做比稀释制备供试品溶液成1:200、1：400……1：12800等8个稀释倍数的样品，以上8个样品分别取0.5ml加入8个离心管内．四、中和实验技术0.5+0.50.5+0.50.5+0.50.5+0.50.5+0.50.5+0.50.5+0.50.5+0.50.3+2.70.3+2.71︰101：1001：2001：4001：8001：16001：32001：64001：128001：25600四、中和实验技术5效价检定用国家标准品的稀释：同供试

8、品溶液的制备0.5+0.50.5+0.50.5+0.50.5+0.50.5+0.50.5+0.50.5+0.