表皮葡萄球菌和分枝杆菌生物膜相关基因的鉴定和功能研究

《表皮葡萄球菌和分枝杆菌生物膜相关基因的鉴定和功能研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、复旦大学博士学位论文表皮葡萄球菌和分枝杆菌生物膜相关基因的鉴定和功能研究姓名：王星申请学位级别：博士专业：病原生物学指导教师：高谦2012-04-08复旦大学博士学位论文中文摘要摘要表皮葡萄球菌是医源性感染的主要致病菌，大部分发生在临床上严重的和免疫力低下的病人身上，同时与医疗植入设备的使用有关。目前，在中国医院环境中流行的表皮葡萄球菌的克隆分型还不清楚，这些克隆型在医院环境中容易传播的原因也不清楚。在研究中，我们用MLST分型的方法对从医院感染病人身上分离出来的80个表皮葡萄球菌菌株进行克隆分型。它们被分成16个不同的克隆型，其中，最流行的ST2包含了所有ica阳性，IS2

2、56阳性，生物膜阳性的菌株。而且发现在医院环境流行的菌株，高达96．25％的都是耐甲氧西林的。80株菌株中共发现有4种SCCmec分型，但是没有一株携带有SCCmecI型。所有的ST2型菌株都携带SCCmecIII型。综上所述，生物膜形成能力和耐药能力的联合使得ST2型能够成功的在医院环境中传播，引起插管感染和菌血症。这与生物膜形成能力被公认为是表皮葡萄球菌致病的主要机制相符。(第一部分)生物膜是细菌黏附于有机或无机材料表面，合成分泌细胞外基质包被细菌所形成的细菌群体结构。生物膜的形成是细菌逃逸宿主免疫清除的主要机制，也是细菌体内播散感染的病灶。因此，对于表皮葡萄球菌生物膜形

3、成分子机制的深入研究，将有助于提供防治表皮葡萄球菌感染的有效措施。在研究中，我们利用转座子对临床分离的生物膜阳性表皮葡萄球菌1457构建了随机插入突变库，通过生物膜半定量的方法筛查了大约1000个菌株，发现12个菌株的生物膜形成明显缺陷。这12个菌株插入到11个不同的基因中，其中有2个基因(ica，aap)是已经报道过的与生物膜相关的基因，其他9个都是新发现的与生物膜相关的基因，包括SERP0541，SERP0142，SERPl657，SERP0270，SERP2282等。我们选择了SERP0541(ygs)基因进行下一步研究。首先，比较野生株和突变株我们发现突变株的生物膜形

4、成明显缺陷且在生物膜形成的第二阶段PIA的合成量也明显减少，通过构建质粒互补回突变株发现突变株的生物膜形成能力能回复到野生株的水平，说明ygs是一个影响生物膜形成的新的基因。既然基因ygs影响生物膜形成是通过PIA，为了进一步研究是否由编码PIA的icaADBC表达水平的改变引起的，我们通过定量PCR的方法检测了ica的表达水平，在对数期我们发现野生株中icaB的表达水平是突变株的9倍，而icaR在突变株的表达水平是野生株的2—3倍，这说明ygs在转录水平通过影响icaR来调节icaADBC的。另外，在各种压力下，包括热，高pH，高盐，乙醇等条件都可以使ygs突变株的生长明显

5、比野生株要慢，这些都说明ygs基因参与了多种应激条件的反应，且通过控制PIA的产量来影响生物膜的形成。而且，ygs基因在大鼠中央静脉插管感染模型复旦大学博士学位论文中文摘要和小鼠皮下置管感染模型的致病性方面都发挥着重要的致病作用。因此，我们得出的结论是脬基因影响了生物膜的集聚和压力的抵抗，在生物膜相关感染中对生物膜的结构和生理发挥着重要的调节作用。(第二部分)分枝杆菌也有形成生物膜的能力，目前已经有报道结核分枝杆菌的生物膜中含有高耐药性的结核菌。结核病现在仍然是致死率仅次于艾滋病的全球第二大感染性疾病，而耐药性是当前结核病控制的难点。因此，对结核生物膜分子机制的研究变得更加重

6、要。耻垢分枝杆菌和海分枝杆菌是近年来发展起来的研究结核分枝杆菌致病性的模式生物。为了筛选出分枝杆菌生物膜相关的新的基因，我们对分枝杆菌的转座子突变库进行筛选，得到几株生物膜表型发生改变的菌株，其中一株插入到aceE基因。我们进一步研究发现aceE突变株菌落形态也发生改变，迁移能力下降，对酸的耐受性降低。这些表型在互补株中都能回复到野生型水平。细菌生物学表型的改变通常与细胞壁的脂质成分改变有关，2D．TLC分析突变株的细胞壁脂质成分发现TAGs和另一种脂质MDAGs都减少，互补株中TAGs能回复到野生型的水平，说明TAGs与菌落形态，生物膜等表型的改变有关。我们还发现在以葡萄糖

7、和甘油作为碳源的7H9培养基中，突变株生长比野生株慢，但是在以乙酸盐作为碳源的培养基中它们的生长没有差异，说明aceE基因参与了糖和甘油作为碳源的吸收。(第三部分)通过海分枝杆菌转座子突变库的筛选，有趣的是，发现三株突变株的转座子插入到同一基因中，这一基因为海分枝杆菌的mmaA4基因，参与分枝菌酸的合成。结核分枝杆菌有三类分枝菌酸，Cc．分枝菌酸，酮(keto)．分枝菌酸和甲氧基(methoxy)．分枝菌酸。mmaA4基因突变会导致后两种分枝菌酸生成缺陷。分枝菌酸和海藻糖组成的仅，G【’一海藻糖二分枝菌