腺相关病毒载体介导人β-ngf和pdgf-b基因联合转染猫角膜内皮细胞的实验研究

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1、青岛大学博士学位论文腺相关病毒载体介导人β--NGF和PDGF--B基因联合转染猫角膜内皮细胞的实验研究姓名：杨珊珊申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：王传富20120522腺相关病毒载体介导人B-NGF和PDfiF-B基因联合转染猫角膜内皮细胞的实验研究中文摘要目的：通过腺相关病毒(AAV)载体介导人B一神经生长因子(B-NGF)基因和人血小板源性生长因子基因B(PDGF．B)联合转染体外培养的猫角膜内皮细胞，探讨其对该细胞生物学效应的影响。方法：体外培养的猫角膜内皮细胞，通过细胞形态学观察、神经特异烯醇化酶(NSE)单克隆抗体免

2、疫荧光染色鉴定细胞的种类及纯度。构建从V载体，利用从V载体介导绿色荧光蛋白(GFP)基因转染猫角膜内皮细胞，根据其阳性表达率测定转染效率。从V—B-NGF和AAV—PDGF—B分别和联合转染猫角膜内皮细胞后，Real-TimePCR及Westernblot分别在mRNA和蛋白水平检测转染24h、48h、72h后B-NGF和PDGF-B的表达变化。从V—B．NGF和从V—PDGF-B分别和联合转染猫角膜内皮细胞72小时后，通过m检测细胞增殖能力的改变，流式细胞仪测定处于G1期的细胞比例，检测外源基因对细胞周期的影响。划痕实验观察从v—B-

3、NGF和从V—PDGF-B对细胞迁移能力的影响。’结果：猫角膜内皮细胞体外培养可形成完整的细胞单层，经形态学观察、NSE免疫荧光染色证明为纯净的猫角膜内皮细胞。AAV介导的绿色荧光蛋白基因转染猫角膜内皮细胞72h后，荧光显微镜下观察可见细胞内清晰的绿色荧光，测得转染效率可达67．81％。从V—B-NGF和从V—PDGF-B分别和联合转染猫内皮细胞后，Real-TimePCR和Westernblot结果显示，转染后各时间点猫角膜内皮细胞中p-NGF和PDGF-B的mRNA和蛋白表达随时间延长不断增高，与对照组相比差异有统计学意义(P

4、05)。联合转染组中B-NGF和PDGF-B在不同时间点的表达与单独转染组差别无统计学意义(P>0．05)。MTT结果显示，AAV—B—NGF和从V—PDGF—B分别和联合转染猫角膜内皮细胞后增殖能力较对照组增强，联合转染组更为明显，差别均有统计学意义(P

5、B-NGF基因和PDGF-B基因转染体外培养的猫角膜内皮细胞，并在猫角膜内皮细胞中持续稳定表达。从v-B-NGF和AAV—PDGF-B分别和联合转染猫角膜内皮细胞后可以增强细胞的增殖和迁移能力，联合转染的效果更加明显。㈤rillITIll111IIIIIII{Y2088503博士研究生：杨珊珊(眼科学)指导教师：王传富教授关键词：角膜内皮细胞；腺相关病毒；J8l一神经生长因子；人血小板源性生长因子B；转染Co-transfectionofhumanI]-NGFandPDGF-Bgeneincatcornealendothelialcel

6、lsviaadeno—associatedvirusmediationAbstractPURPOSE：Toresearchthebiologicaleffectofco-Wansfcctionofadeno-associatedvirus(AAV)mediatedhumanncl"Vegrowthfactor-8(8-NCF)andhumanplatcletderivedgrowthfactorB(PDGF．B)incatcornealendothelialcellsinvitro．1垤ETHODS：Catcornealendothcl

7、ialcellsWCI'eculturedinvitro．Thetypeandpurityoftheendothelialcellswe坞furthcTconfirmedbymorphologicalanalysisandNSEimmunofluoresce_ncestudy．Afterformingtheadcno-associatedvirusvector,catcornealendothelialcellswe他transfcctedby础wmediatedgreenfluorescentprotein(GFP)gene．Then

8、theel五cicncyoftransfcctionWaScwaluatedaccordingtopositiveexpressionofGFRHumanB．NGFgeneandhumanPDGF．Bgon