胎盘钙化组织中纳米细菌的分离培养与鉴定及其相关蛋白的初步分析

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1、重庆医科大学博士学位论文胎盘钙化组织中纳米细菌的分离培养与鉴定及其相关蛋白的初步分析姓名：郭亚楠申请学位级别：博士专业：病原生物学指导教师：张德纯201205重庆医科大学博士研究生学位论文胎盘钙化组织中纳米细菌的分离培养与鉴定及其相关蛋白的初步分析摘要第一部分胎盘钙化组织中纳米细菌的分离与培养背景：芬兰科学家Kajander教授及其团队最早从哺乳动物细胞培养过程发现细胞的空泡样变化，在排除了一切可能的微生物污染的情况下对其进行分析，发现了一种可以自我复制矿化且直径只有50—800nm的微生物，命名为纳米细菌(NanobacteriaNB)并申请了专利1。利用傅里

2、叶变换色散光谱分析(FTIR)表明纳米细菌外壳的主要成分为羟磷灰石，所以又称为纳米矿化颗粒(CNPs)。有科学家在透射电镜下观察早期钙化胎盘组织发现纳米矿化颗粒的存在，但未能分离培养出纳米细菌。目的：从胎盘钙化组织和相应胎儿脐带血中分离培养出与钙化相关的纳米细菌，观察其生长特性，探讨胎盘钙化发生的微生物感染证据以及胎盘钙化与胎儿纳米细菌感染的关系。方法：以临床所取36份胎盘钙化组织作为研究对象，透射电镜观察钙化组织中的纳米细菌。而后依次利用lmol／L盐酸脱矿，Tris中和，国家自然科学基金(NO．31000075)2重庆医科大学博士研宄生学位论文生理盐水稀释，

3、14，0009高速离心，最后通过O．221．tin细菌滤器过滤的方法进行分离。滤液过滤到有棉塞试管中，加入含有lO％胎牛血清的RPMI1640细胞培养基，调整pH7．4，放入37℃细胞培养箱，5％co。，95％空气条件下培养。观察细菌生长情况并依据沉淀类型分类。OD650波长下记录纳米细菌菌液相对浓度OD值，制作生长曲线。胎牛血清(FBS)和生理盐水作为试剂对照，无钙化的正常胎盘组织作为实验对照，用RPMI1640培养基作为空白对照。同时对存在胎盘钙化的胎儿取脐带血，对纳米细菌进行分离培养，方法同上。结果：透射电镜下观察钙化胎盘组织标本，可见胎盘绒毛组织和钙化斑

4、块之间存在椭圆形纳米颗粒，其直径约为50-500nm，每个颗粒都被具有不同电子密度的薄外壳包围，其中有些颗粒可见分裂，与国内外文献报道相似。实验组中有28例可见白色沉淀完全或部分粘附在试管底部，对照组未见沉淀产生，差异具有显著性(P<0．01)。OD650分光光度计下记录得到纳米颗粒生长曲线与其他细菌类似。脐带血分离培养的结果与相应钙化组织胎盘中纳米细菌培养的结果正相关，有12例实验组培养物可见白色沉淀物，对照组未见(P<0．01)。结论：通过纳米细菌分离培养的方法可以从钙化胎盘组织中得到具有自我复制矿化功能的纳米颗粒，且存在胎盘钙化的胎儿也较易感染此纳米颗粒。

5、．关键词：纳米细菌；胎盘钙化；脐带血；分离培养3重庆医科大学博士研究生学位论文第二部分钙化胎盘组织中纳米细菌的鉴定背景：进一步对培养所得白色沉淀物进行形态学和基因组学的鉴定。由于纳米细菌形态微小，有的还不足100nm，因此许多科学家认为它并不存在遗传基因，也不属于生物范畴。KNander教授向GenBank中提交了纳米细菌特异的16SrRNA基因序列X98418，因此后续科学家多依据这个序列对分离培养出的纳米细菌进行种属鉴定。目的：利用透射电镜，扫描电镜，茜素红染色和16SrRNA基因分析的方法对分离培养得到的纳米细菌进行进一步鉴定。方法：①透射电镜观察：纳米细

6、菌14，0009高速离心沉淀，戊二醛前固定，四氧化二锇后固定，梯度脱水，环氧树脂包埋，制作超薄切片，双重电子染色，双蒸水洗涤，干燥后在透射电镜下观察拍照。②扫描电镜观察：纳米细菌沉淀利用戊二醛固定，常规脱水，临界点干燥，喷金，在扫描电镜下观察拍照。③茜素红染色：培养标本涂片固定，冲洗，2％茜素红染液染，0．2％淡绿水溶液复染，0．5％醋酸水溶液冲洗，乙醇脱水，烘干后用中性树胶封片，高倍镜下观察拍照。④16SrRNA基因序列分析：提取纳米细菌基因组，设计纳米细菌16SrRNA基因序列特异性引物，PCR扩增其特异性序列，凝胶电泳观察并回收目的片段，送检进行基因序列分

7、析，结果与GenBank比对。根据比对结果设计新发现纳米细菌16SrRNA基因特异性引物，对胎盘钙化组织进行16SrRNA基因序列分析，其结果与新发现纳米细菌进行比对，验证提取过程有无污染菌。再将所得菌株与GenBank中所收录纳米细菌相关16SrRNA基因做系统进化分析，绘制系统进化树。4重庆医科大学博士研究生学位论文结果：①透射电镜下可见菌液中的纳米细菌呈椭圆形，直径在200-500nm，有或没有高电子密度的外壳包绕在外。②扫描电镜下可见纳米细菌形态微小，单个颗粒直径在200nm左右，或聚集成微米大小团块。③茜素红染色可见纳米细菌染成红色细小颗粒。④16Sr

8、RNA基因分析发现胎盘钙