禽白血病病毒(alv)的分离与鉴定及针对a、b亚群alv gp85囊膜蛋白单克隆抗体的研制

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1、禽白血病病毒(ALV)的分离与鉴定及针对A、B亚群ALVgp85囊膜蛋白单克隆抗体的研制IdentificationofAvianLeukosisVirusIsolates(ALV)andPreparationofMonoclonalAntibodiesforgp85ofSubgroupAandBALV研究生：范俊青专业：预防兽医学导师：吴艳涛教授扬州大学兽医学院2012年6月范俊青：禽白血病病毒(ALV)的分离一与鉴定及针对A、B弧群ALVgp85囊膜蛋白单克隆抗体的研制!禽白血病病毒(ALV)的分离与鉴定及针对A、B亚群ALV

2、gp85囊膜蛋白单克隆抗体的研制摘要IUllIIIIIIIIIIIIIIlY2258810禽白血病是由禽白血病病毒(avianleukosisvirus，ALV)引起的。该病不仅能引起鸡的多种肿瘤性疾病，还能引起感染鸡的免疫抑制，具有可垂直传播的特性。目前，种群净化是防控禽白血病最有效的途径。由于我国从未对ALV采取过有效的净化措施，鸡群、尤其地方品系中存在ALV感染的可能性很大。在过去十几年中，我国对J亚群禽白血病的流行状况做了大量报道。但对J亚群以外其它亚群ALV研究的还比较少。本研究首先采用DFl细胞接种、检测p27抗原、聚

3、合酶链式反应(PCR)的方法，从各地送检的疑似ALV的病料中分离到7株ALV毒株。为了确定7株分离株的亚群类型，克隆和测序了其gp85基因，并将其与已知的ALV各亚群的gp85基因序列进行了同源性比较。结果表明：7株分离株中2株为ALV-A毒株、4株为ALV-B毒株和1株为ALV-J毒株。这说明我国鸡群中存在A、B亚群ALV的感染。本研究设计了两对特异性引物，应用PCR方法分别扩增ALV．A和ALV．Bgp85蛋白编码区，经克隆测序『F确后，将目的基因分别克隆入原核表达载体pET．32a(+)和pGEX一6P一1构建成两种不同融合

4、表达方式的重组质粒，分别命名为pET-A-gp85、pET-B-gp85、pGEX—A—gp85和pGEX．B．gp85。重组质粒转化BL21(DE3)或BL21宿主菌后，用IPTG进行诱导表达，经SDS．PAGE鉴定，携带pET—A—gp85、pGEX—A-gp85和pGEX-B-gp85等三种表达载体的重组菌能够『F确表达相应的重组蛋白。将重组菌用IPTG大量诱导表达，分别用High—AffinityNi—IDAResin和High—AffinityGSTResin进行重组蛋白纯化。将纯化后的重组蛋白用弗氏完全佐剂乳化后免疫6

5、周龄BALB／c小鼠，问隔两周加强免疫一次(第二、三次免疫用弗氏不完全佐剂)。第三次免疫两周后用等量抗原(无佐剂)腹腔免疫一次，三天后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／0融合。用纯化的蛋白包被ELISA反应板，对融合成功的杂交瘤细胞进行筛选。选取阳性孔进行亚克隆，获得稳定分泌抗ALV—Agp85抗原的单抗杂交瘤细胞系2株，命名为A5D1和A6C6；获得稳定分泌抗ALV—Bgp85抗原的单抗杂交瘤细胞系2株，命名为B2C11和B687。经测定，A5D1和A6C6腹水f刚接ELISA效价均达到1：204800，B2C11和B687效价均

6、达到1：409600。单抗A5D1、扬州人学硕十学位论文2一B2C11和B687亚类为IgGl，A6C6为IgG2a。Western—blot和IFA试验结果表明，所获单抗A5D1和A6C6仅能与ALV—Agp85蛋白发生反应，而B2C11和B687仅能与ALV·Bgp85蛋白发生反应，说明所获得的单抗具有良好的特异性，能够区分ALV—A和ALV—B。本研究为研制ALV—A和ALV—B亚群特异性病毒抗原检测方法奠定了基础。关键词：禽白血病病毒；ALV—A；ALV—B；gp85蛋白；单克隆抗体范俊青：禽白血病病毒(ALV)的分离与鉴

7、定及针对A、BⅡ群ALVgp85囊膜蛋白单克隆抗体的研制三IdentificationofAvianLeukosisVirusIsolates(ALV)andPreparationofMonoclonalAntibodiesforgp85ProteinsofSubgroupAandBALVAbstractAvianleukosisiscausedbyavianleukosisvirus(ALV)．ALVinfectionofchickensiswidespreaddistributedandknowntobecapableofin

8、ducingavarietyoftumordiseasesandimmunosuppression．AstheALVshaveacapacityofverticaltransmission，thepopulationcleaningistheonl