a和b亚群禽白血病病毒gp85基因的表达及其抗血清的亚群特异性比较

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1、山东农业大学硕士学位论文A和B亚群禽白血病病毒gp85基因的表达及其抗血清的亚群特异性比较姓名：王丽申请学位级别：硕士专业：预防兽医指导教师：崔治中20120615山东农业大学硕士学位论文。中文摘要为制备相应的特异性抗体用于快速分离鉴定～『B亚群的ALV，本实验分别克隆表达了A亚群禽白血病病毒(AL、，-A)SDAU09Cl株和B亚群禽白血病病毒(ALv-B)SDAU09C2株的囊膜gp85基因，尝试应用gp85基因的表达产物免疫家兔来获取大量高效价的特异抗血清。根据已发表A亚群禽白血病病毒(ALV-A)SDAU09C1株和B亚群禽白血病病毒(

2、ALv-B)SDAU09C2株基因序列，利用pIIimer5．O设计并合成一对引物。利用PCR方法扩增两毒株的囊膜gp85基因片段，将目的片段克隆至pMDl8．T载体并转化感受态细胞BL2l(DH50【)，构建重组载体。经核酸序列测定，克隆的基因片段分别长1017bp，1038bp，为gp85基因开放性读码框的全长序列，分别编码339，346个氨基酸。将gp85基因片段分别连接至pET-32a(+)表达载体中，经抗性筛选、PCR扩增、限制性内切酶分析，筛选获得目的片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆，分别命名为pET．SDAU09C1一gp85

3、和pET-SDAU09C2一gp85。阳性克隆质粒转入E∞肛BL21(Rosetta)宿主菌，经IPTG诱导表达，SDS．PAGE电泳表明重组蛋白以包涵体的形式出现。通过诱导表达条件的优化，确立了最佳的诱导条件为30℃，lmMIPTG浓度，诱导表达5h。因融合蛋白氨基端含有6个组氨酸，用镍金属亲和层析纯化目的蛋白。取A亚群禽白血病病毒(ALv-A)SDAU09Cl株和B亚群禽白血病病毒(ALv-B)SDAU09C2株的阳性鸡血清分别进行wbstemblotting检测，结果显示表达的重组蛋白是特异性的。将纯化的融合蛋白按常规方法免疫家兔，三免后

4、一周，心脏采血分离血清。取两种抗血清进行间接免疫荧光反应(IFA)测定效价，效价均可达l：500，其中SDAU09C1抗血清在1：100稀释时效果较好，而SDAU09C2抗血清在1：50稀释时效果较好。取抗血清最佳稀释度与本实验室保存的A亚群禽白血病病毒SDAU09E1株，SDAU09C3株，和J亚群禽白血病病毒HN0001株进行IFA区分鉴定。结果不论是A亚群SDAU09C1血清还是B亚群SDAU09C2血清都能与A或B亚群的不同毒株发生阳性反应，但效价不同。然而，二种血清都不与J亚群韵Nx0101株发生反应。用制备的两种抗血清，采用固定病毒

5、(200TCID50)稀释血清的方法进行交叉中和反应。结果显示，抗SDAU09Cl株gp85产生的兔血清的抗体效价比较高，对两个分离株都有较高的中和效价。而且对SDAU09C2株的中和效价甚至高于SDAU09C2株抗血清对自身病毒的中和值，但每一种血清对自身病毒的中和值都明显高于对异源病毒的中A和B亚群禽白血病病毒gp85基因的表达及其抗血清的亚群特异性比较和值。为此，本实验计算和分析了二株病毒间抗原性相关系数r值，结果显示SDAU09C1株与SDAU09C2株在病毒交叉中和反应中的r值为36．6％。关键词：禽白血病病毒；重组gp85；兔抗gp

6、85血清；病毒交叉中和反应山东农业大学硕士学位论文ABSTRACTInordertogetarapidspecificdiagIlosticreagentforsubgroupA／BAViallLeul(osisVimsdetectionandcomparetheantigenicrelatedllessofa11ti-gp85serumofChineses缸缸nSDAU09C1ofsubgroupAaViallleul【osisVimses锄dSDAU09C2ofsubgroupBaVianleukosisVimses．Therecombin

7、aultgp85proteinhadbeenexpressedaIldaIlti—senunwausmadebyinununizingrabbitswitllpurifiedgp85protein．．EnV—gp85geneⅥ粥amplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)、Ⅳithapairof州mersdesignedaccordingtotllepubliShedgp85genesequence矗omplaSmidsreSpectiVelycontainingt11eenvgeneofChineses仃ai

8、llSDAU09ClofsubgroupAaViallleuI(osisVirusesandSDAU09C2ofsub笋oupBaviaIllelll