环节四 研究方法

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1、环节四研究方法案例加拿大“一枝黄花”多糖的提取以及抑癌作用的研究一、选题依据（背景与意义、国内外研究现状与发展趋势）加拿大“一枝黄花”（Solidago canadensis）是一种菊科多年生草本植物，又名“霸王花”，原产北美，花黄色。1935年作为观赏植物引进我国，上世纪八十年代扩散蔓延，成为河滩、路边荒地、铁路两侧、农田边、平原城镇住宅旁生长的恶性杂草。加拿大“一枝黄花”适应能力极强，具有快速繁殖,快速占领空间的能力。一株加拿大“一枝黄花”可繁殖两万余株，一旦蔓延，植被造成严重破坏，无法种植农作物，并且难以根除。目前对加拿大“一枝黄花”处理方法有喷药和人工铲除并焚烧，这两种方法不仅

2、耗费资金而且污染环境。因此本实验试图探究加拿大“一枝黄花”的有效成分，希望能寻找到加拿大“一枝黄花”处理的既环保有能创造经济价值的新方法。二、研究目标与主要内容1、研究的目标：寻找加拿大“一枝黄花”处理的既环保有能创造经济价值的新方法。2、主要内容：（1）加拿大“一枝黄花”多糖的提取（2）加拿大“一枝黄花”多糖样品液稳定性试验（3）加拿大“一枝黄花”多糖含量的测定（4）MTT比色法研究加拿大“一枝黄花”多糖提取液抑癌作用三、拟采取的研究方法、研究手段及技术路线、实验方案等1材料、试剂与仪器1.1材料加拿大“一枝黄花”，于2005年10月采于道路旁，采后洗净烘干。乳腺癌细胞Bcap-37

3、购于上海市中科院细胞所1.2试剂石油醚、活性炭、三氯乙酸、氯仿、正丁醇、95%乙醇、标准葡萄糖、苯酚、浓硫酸、高纯水、甲醇色谱纯、DMEM培养液、MTT、二甲基亚砜(DMSO)。1.3仪器数显恒温水浴锅、索式抽提器、756紫外可见光光度计、电子天平、离心机、恒温干燥箱、微孔抽滤器、无菌操作台、细胞培养箱、电磁力搅拌机、倒置显微镜、振荡混合仪、酶联免疫检测仪（华东师范大学生物医学实验室）。2实验方法步骤2.1加拿大“一枝黄花”多糖的提取2.1.1预处理将加拿大“一枝黄花”茎叶风干研细成粉末，称取7.0g，至于索式抽提器内用石油醚回流抽取8h，除脂。除脂后样品风干，保存。2.1.2热水浴浸

4、提将脱脂样品至于三角烧瓶中，按料液比1：10～40加水，90℃水浴2h，然后过滤，保留滤液，滤渣在进行水提，重复3次，合并滤液。2.1.3脱色因水提液含有黄绿色素成分，故在滤液中加适量的活性炭，90℃水浴0.5h进行脱色，然后抽滤，保留滤液。2.1.4除蛋白脱色后的滤液加三氯乙酸静置过夜除蛋白。由于效果不明显，再用Sevage法除蛋白。取50ml浓溶液，将氯仿按滤液1/5体积加入，然后再加入氯仿体积1/5的正丁醇，充分混合振摇20min，离心，吸去水层和溶液层交界处的变性蛋白。上述方法重复两次，得脱蛋白液。2.1.5醇析取30ml脱蛋白液加95%乙醇充分混合，静置，冰箱过夜，析出多糖。

5、抽滤取沉淀，用烘箱干燥，得到样品粉末，即为加拿大“一枝黄花”精制多糖。2.2多糖标准曲线的绘制2.2.1标准溶液的配制将适量葡萄糖粉末放入烘箱烘干105℃至恒重，取5.0mg，用蒸馏水定容到50ml容量瓶中，得浓度为0.1mg/ml的葡萄糖标准液。2.2.2硫酸-苯酚试液的配制取40g苯酚水溶液置于冰箱内避光保存。临用前取80%饱和苯酚溶液7.5ml，用蒸馏水定容到100ml容量瓶中，配制成6%苯酚溶液。2.2.3标准曲线的绘制分别吸取葡萄糖标准液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0ml，各以蒸馏水补至2.0ml，再分别加入6%苯酚1.0ml，混合，再分别加入

6、浓硫酸5.0ml静置10min，振摇，在放置20min,然后使用分光光度计在波长490nm处测吸光度值，空白对照以蒸馏水代替糖溶液。各浓度葡萄糖标准液分别测定3次，绘制标准曲线。2.3换算因子的确定准确称取干燥恒重的加拿大“一枝黄花”精制多糖20mg，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，得精制多糖样品溶液，浓度为0.20mg/ml。准确吸取该多糖溶液1.0ml，按照“2.2.3”起得方法测定吸光度，由回归方程计算试液中葡萄糖的含量，按下式计算换算因子。换算因子：f=W/(C·D)，式中，W：称取多糖的质量（mg）；C：测得多糖中葡萄糖的含量；D：多糖的稀释倍数（此处D为2×100

7、=200）2.4加拿大“一枝黄花”多糖含量的测定2.4.1加拿大“一枝黄花”多糖样品液的制备将加拿大“一枝黄花”茎叶风干研细成粉末，称取7.0g，至于索式抽提器内用石油醚回流抽取8h，除脂。除脂后样品风干，保存。将脱脂样品至于三角烧瓶中，按料液比1：10～40加水，90℃水浴2h，然后过滤，保留滤液，滤渣在进行水提，重复3次，合并滤液。因水提液含有黄绿色素成分，故在滤液中加适量的活性炭，90℃水浴0.5h进行脱色，然后抽滤，保留滤液。并定容到1