牙龈卟啉单胞菌hgp44基因诱导人脐静脉内皮细胞分泌il-6,il-8的研究

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1、浙江大学硕士学位论文牙龈卟啉单胞菌Hgp44基因诱导人脐静脉内皮细胞分泌IL--6,IL--8的研究姓名：张杰申请学位级别：硕士专业：口腔临床医学指导教师：陈晖20120227浙江大学硕上学位论文中文摘要牙龈卟啉单胞菌Hgp44基因诱导入脐静脉内皮细胞分泌IL．6，IL．8的研究浙江大学医学院硕士研究生导师‘n—VIH口腔临床医学张杰陈晖教授中文摘要【目的1克隆表达牙龈卟啉单胞菌(Po印hyromonasgin西valis，P．g)牙龈素中粘附素区域的Hgp44基因，并纯化目的蛋白．观察Hgp44基

2、因作用于人脐静脉内皮细胞后对其产生IL．6，IL．8的影响。【方法】通过PCR和基因重组技术，克隆得到P．gATCC33277的Hgp·44基因，插入到克隆载体pMDl8．T中并测序鉴定。经过酶切后将目的基因片段与表达载体pE佗2b相连，构建出表达质粒pE亿2b．H洲．将重组质粒转化到感受态细胞BL2l(DE3)中，用IPTG诱导表达融合蛋白，通过SDS．PAGE，Westemb10t进行分析．用固定化金属亲和层析法(IMAC)对重组蛋白进行分离纯化，从而获得目的蛋白Hgp44．培养人脐静脉内皮细胞

3、，用不同浓度的Hgp44蛋白分别作用于HUVEcs，用ELISA试剂盒检测IL．6，儿．8的表达变化．II浙江大学硕I：学位论文中文摘要I结果l成功培养牙龈卟啉单胞茵ATCC33277菌株，并克隆得到目的基因片段，约为1100bp，与预期大小相符，测序结果与GenBank中ATCC33277国际标准菌株的IⅧA的等位基因序列U15282一致。IPTG诱导后的菌体经sDS．PAGE后形成一个以包涵体形式存在的44l①的融合蛋白。W

4、estemblot检测证实其具有免疫原性。用Ni-NTA柱纯化后复性得

5、到了目的蛋白Hgp44。最后得到终浓度约3．5mg／L的目的蛋白Hgp44．ELISA检测分析得到，Hgp44能促进HUⅥ!Cs分泌IL-6和IL-8，从而引起初始的炎症反应．【结论l成功克隆表达了牙龈口卜啉单胞茵Hgp44基因，并纯化出了目的蛋白．明确了目的蛋白对人脐静脉内皮细胞产生IL-6，IL一8的影响，为进一步阐明Hgp44和人内皮细胞的相互作用关系及明确牙龈卟啉单胞茵与心血管疾病之间的关系奠定了基础．I关键词l牙龈卟啉单胞茵；Hgp44；原核表达；蛋白纯化；人脐静脉内皮细胞；IL一6；IL

6、．8nl塑鎏奎堂硕士学位论文英文摘要ThestudyofHgp44fJromPorphyromonasgingivalisoninducingHUVECstosecreteIL-6andIL一8Dep2urtmentofStomatology，Medicalschool，ZhejiangUniVersity【objective】PostgraduateCandidate：ZhangJieSuperVisor：PI．o￡ChenHuiAbstractTbclone，expressⅡ比geneofHgp

7、44madhesindomaillsof西n西pajIlsfbmPo叩hyromon勰gingiValis(户曲a11dp嘶黟t11eprotein-M跚w11ile，obSeryingt11ee髓ctofHgp44仔omPo印hyromon硒gin西ValisoniIlducingHUVECst0secreteIL．6柚dIL一8．【Methods】Theg明。删cDNAofPgw嬲isolated舫m尸gATCC33277．TheHgp44gene触gmentw鹤锄pIifiedbypoIyme

8、r舔echain陀action(PCR)孤dtIleninsenI甜irIt0tllecIoningVectorpMDl8·T锄d∞quenced．1kc0玎ectlyfhgmem、Ⅳ鹤linl(ed诵tllaprokaD，oticexpressionVectOrpET．22bt0constmcttller∞ombin锄texpressi伽pl嬲midpET22b-Hgp44．ThepET22KHgp44wKchhadbe饥collfi肌edbyeI珂medigeStionw嬲眦略fo咖ed硫oC0

9、m叫entE．coliBL2l(DE3)cells．Exprcssionof觚ionproteiIlw弱induccdbyIPTG卸dp面fiedbyil姗obilizedme伽．chelatinga币nit)rcllmmato鲫hy(IMAC)uSingaNi2+ma臼奴COI咖．SDS．PAGE锄dWbst锄BIoningaIlalysiswe陀惦edt0exalTIi舱tllemsionprotein．浙江大学硕I?学位论文英文摘要HUVECsWerecultu