桃褐腐病菌cyt b基因1166bp内含子对g143a突变影响的分子机理初步研究

《桃褐腐病菌cyt b基因1166bp内含子对g143a突变影响的分子机理初步研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、华中农业大学硕士学位论文桃褐腐病菌Cytb基因1166bp内含子对G143A突变影响的分子机理初步研究姓名：陈育申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：罗朝喜201206挑褐腐病菌Cytb基因1166bp内含子对G143A突变影qhJA,'J分子机理初探初步研究摘要由链核盘菌(Monilinaspp)引起的桃褐腐病是世界范围内桃园里的重要病害之一，而美澳型核果链核盘菌(Mfructicola)在我国许多桃产区均能采集得到，是我国的优势菌种。国内外用于防治该病主要采用苯丙咪唑类、麦角甾醇合成抑制剂和甲氧基丙烯酸酯类呼吸抑制剂这三大类杀菌剂。目前

2、已经在田间发现了对前两类杀菌剂的抗性菌株，而呼吸抑制剂类抗性菌株尚未发现。通过克隆呼吸抑制剂类杀菌剂靶标基因@fb序列得知，在突变发生热点G413的编码序列GGT后存在一个1166bp内含子，是否由于该内含子的存在影响了G143A突变的发生而不能产生抗药性，本文就这个问题进行了初步探索。本文采用三种方法来探索该分子机理。首先是同源置换，采用PEG介导的原生质体转化进行两次敲除，将含有G143A突变引入到@fb基因中，检测该基因的转录和翻译。其次是插入突变，建立农杆菌介导的孢子转化体系，将含有G143A突变的Cytb基因插入到核基因组中，检测该基因

3、的转录和翻译。最后是酵母异源表达，采用成熟的酵母表达体系，在酵母DNA中引入Mfi'ucticola的C1，fbeDNA和G143编码基因后的内含子，检测该内含予正常剪切和G143A突变之间是否互相影响。本文首先研究了PEG介导的Mfructicola原生质体遗传转化体系，2009／ml潮霉素浓度为对应菌株的最小抑制浓度(MIC)值。经优化得到了原生质体最佳制备条件：采用CM液体培养基+玻璃珠摇培3天，收集菌丝。用1．5mg／ml蜗牛酶(Snailase)和10mg／ml溶菌酶(Lysozyme)的酶组合酶解3h，能得到高质量的原生质体。在农杆菌

4、介导的Mfructicola孢子遗传转化实验中，确认了Mfructicola孢子平均含有3．4个细胞核，并初步建立了农杆菌介导的Mfructicola孢子遗传转化体系。利用酵母表达体系，成功构建酵母表达质粒，将含有G143A突变的Cytb基因连同1166bp的内含子转入酵母细胞DNA中，以野生型Cytb基因连同1166bp的内含子转入酵母细胞DNA中的转化子作为对照，分别检测其对应的Cytb基因成熟mRNA的合成，无论野生型还是突变型都无法剪切掉该内含子，外源基因无法在酵母细胞中剪切自身内含子。综述所述，针对1166bp内含子对G143A突变影响

5、的研究，本文做了大量尝试和探索，为后续的研究打下了坚实的基础。关键词：桃褐腐：原生质体；农杆菌介导转化；酵母异源表达l华中农业大学2012届硕士研究生学位论文Absll"actBrownrotcausedbyMonilinaspp．isoneoftheimportantdiseasesofpeach．MoniliniafructicolaisthedominantspeciesinChinawhichcanbecollectedinmanyorchardsindifferentareas．Currently,themostefficientmet

6、hodtocontrolthisdiseaseiSfungicideapplicationsuchasbenzimidazoles(BZIs)，ergosteroldemethylationinhibitors(DMIs)andthequinoneoutsideinhibitors(Qols)．ResistantstrainstoBZIandDMIfungicideshavebeendetectedinthefield，buttheQoIresistantstrainshavenotyetfound．Thecytochromeb(cytb)gen

7、e，thetargetgeneoftheQoIfungicideswasclonedandsequenced．Interestingly,a166bpintronwasfoundattheposition143ofthe@fbpredictedaminoacidsequence．QoIfungicideresistanceisconferredbyasinglepointmutationatposition143fromglycinetoalanine(G143A)inthecytbgeneofmanypathogens．Thepresenceo

8、fanintronattheposition143hasbeenshowntopreventtheformationoftheG143A