携带干扰素-β基因的腺病毒治疗结肠癌肝转移小鼠模型的实验研究

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1、第二军医大学硕士学位论文携带干扰素--β基因的腺病毒治疗结肠癌肝转移小鼠模型的实验研究姓名：郑涛申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：杨甲梅201205携带干扰素一D基因的腺病毒治疗结肠癌肝转移小鼠模型的实验研究摘要研究背景和目的转移性肝癌也称继发性肝癌，属于恶性肿瘤晚期的表现。肝脏由于有肝动脉、门静脉双重血供，故许多脏器的恶性肿瘤易发生肝脏转移。结肠癌肝转移是最常见的转移性肝癌，在首次确诊或复发时约40"--50％存在肝转移，其主要途径为经门静脉转移。肾癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、恶性黑色素瘤等则可经肝动脉转

2、移入肝。尸检表明，我国转移性肝癌为原发性肝癌的1．2倍，欧美则为20倍，近年来此病的发生率还在逐年上升。对转移性肝癌治疗的效果直接影响患者生存质量和生存期，但转移性肝癌又是肿瘤治疗中十分棘手的难题。虽然目前各种治疗方法较多，但仍无法从根本上改变转移性肝癌的预后。随着肝脏外科技术及围手术期处理水平的提高，肝切除术目前被认为是结肠癌肝转移唯一能够获得长期生存的治疗手段，其3年生存率可达50％。但仅仅只有不到1／4的患者适合手术治疗。即使是肝脏转移瘤切除术后，最终仍有60％"-70％的患者出现不同部位的复发。传统的治

3、疗方法(如单纯静脉化疗)对转移性肝癌并不能够显著延长患者的生存期。虽然近年来联合静脉化疗和靶向药物治疗的研究获得可喜进展，使得整体疗效有了很大改善，但化疗引起的不良反应和肿瘤细胞对化疗药物的耐药、靶向药物费用高昂都限制了这些药物在临床的广泛使用。最近的研究资料显示干扰素．p具有较强的抗肿瘤作用。体外研究发现干扰素．B具有抑制肿瘤细胞的增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。在一项抑制黑色素瘤细胞系的研究中发现，干扰素D与干扰素0【2相比在诱导肿瘤细胞凋亡的作用更强，其机制可能与TRAIL／Ap02L相关。体内研究发现干扰

4、素B可抑制肿瘤血管生成，其作用机制可能是通过抑制VEGF、MMP9等血管生成因子的基因编码直接抑制肿瘤血管形成。而肿瘤血管形成在转移性肝癌的发生中起着关键作用。这为使用干扰素p对肿瘤进行治疗提供了依据，但是由于单纯使用干扰素p治疗存在半衰期较短，需要大剂量频繁给药，使得很多患者不能耐受，故很难直接用于临床使用。为克服上述问题，有研究证实使用腺病毒载体的干扰素．p基因治疗在包括卵巢癌、膀胱癌、神经胶质瘤、肺癌取得较好效果。基因治疗是一种新型的治疗疾病的方法，它通过载体把正常基因或有治疗作用的基因导入靶细胞或生物体

5、内，从而达到治疗疾病的目的。近年来，重组逆转录病毒载体已经被作为一种较常用的基因转移工具应用于基因治疗及其他研究领域。本实验以IFN．p基因为目的基因，利用复制缺陷型腺病毒作为基因治疗的载体，同时建立结肠癌·l-第二军医大学硕士学位论文肝转移小鼠模型，经腹腔注射给药的方式，观察INF．p基因治疗结肠癌肝转移的疗效。。⋯研究方法和结果一、携带IFN．13l腺病毒载体的构建和鉴定将IFN．B基因插入到含有CMV启动子的腺病毒载体plRES2．EGFP中获得腺病毒穿梭载体pIRES2．EGFP．IFNB，使用Invi

6、trogen的BP重组系统将目的片段IFNl3-IRES—EGFP重组到中间载体pDONR221上，经纯化扩增后再将pDONR221．IFNl3．IRES．EGFP中间载体上携带的目的片段重组到腺病毒载体pAd／CMWV5．DEST。而后经293细胞包装，收获病毒液纯化，提取病毒基因组进行PCR鉴定，鉴定正确的腺病毒命名为AdlFN．13．EGFP。经293细胞扩增、氯化铯(CsCI)密度梯度离心纯化、TCID50测得病毒AdlFN．B．EGFP滴度为5．25x108TCID50／ml。二、表达IFN—p的腺病

7、毒对小鼠结肠癌细胞(C26)的体外作用研究(一)用AdlFN．B．EGFP和AdEGFP分别以MOI值=20、50、100、200感染C26细胞，48h后荧光显微镜下计算转染效率，结果表明转染效率随着MOI值的升高而提高，20、50、100及200MOI值的AdlFN．p．EGFP对C26细胞的转染率分别为18％、45％、95％、99％。(二)ELISA方法定量检测腺病毒AdlFN．13．EGFP感染C26细胞后IFN．13蛋白的表达。根据检测数据可以得出当MOI=100时，2d、4d、6d和8d测得IFN．D

8、的表达量为915．184-407．40pg／ml。(三)MTT比色法检测AdlFN-p-EGFP和AdEGFP转染C26细胞对细胞生长的影响。用AdlFN．p．EGFP和AdEGFP分别以MOI值=100感染C26细胞，分别转染后24h、48h、72h进行MTT检测并绘制细胞生长曲线图。统计分析发现，AdEGFP对C26细胞的增殖无明显影响，AdlFN．B．EGFP有抑制C26细胞增殖