东方巴贝斯虫棒状体相关蛋白1(rap1)基因克隆及免疫特性研究

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1、华中农业大学硕士学位论文东方巴贝斯虫棒状体相关蛋白1（RAP1）基因克隆及免疫特性研究姓名：张文杰申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：赵俊龙201206东方巴贝斯虫棒状体相关蛋白1(RAPl)基因克隆及免疫特性研究摘要东方巴贝斯虫(Babesiaorientalis，简称：B．0)是一种由镰形扇头蜱经卵传播的血液原虫，主要引起水牛发病，临床症状以高热，贫血，黄疸，消瘦和血红蛋白尿等为特征，严重时导致水牛死亡。东方巴贝斯虫的发现到目前已经有二十多年，尽管对其形态学、流行病学、生活史、分子分类和诊断技术等方面进行了详细的研究，但关于该病原的入侵机制以及候选疫苗筛选

2、等方面的研究仍然有限。因此，本研究在建立的东方巴贝斯虫基因组数据库的基础上，克隆与虫体入侵相关的棒状体相关蛋白l(RAPl)基因，对其进行氨基酸序列和进化分析，随后对其进行原核表达及免疫荧光定位，从而为阐明东方巴贝斯虫的入侵和免疫机制提供依据。(1)东方巴贝斯虫RAPl基因克隆及其结构预测根据从数据库获取的东方巴贝斯虫RAPl基因的相关信息设计一对特异性的引物RAPl一F／RAPl．R，从东方巴贝斯虫基因组扩增到一条1732bp的包含RAPl基因全长的序列。基因序列分析表明其包含一个1434bp的ORF，编码477个氨基酸。同源性分析表明，此蛋白基因序列与羊巴贝斯虫R

3、APl(BabesiaovisRAPl)基因(GenBank序列号：M91173．1)的第二个CDS序列同源性最高为71％；与牛巴贝斯虫(Babesiabovis；AF030058．1)、驽巴贝斯虫(Babesiacaballi；AB017700．1)、犬巴贝斯虫(Babesiacan&；M91168．1)的同源性分别为68％、63％和64％。预测的氨基酸序列与牛巴贝斯虫(GenBank序列号：AAB84268．1)的同源性最高为58％；与羊巴贝斯虫(AAA27805．1)、驽巴贝斯虫(ADF30793．1)、犬巴贝斯虫(AAA27807．1)的同源性分别为43％、4

4、8％和42％。RAPl氨基酸序列的进化分析表明东方巴贝斯虫是归属于巴贝斯虫的一个独立的新种。结构分析表明，它具有巴贝斯虫RAPl基因家族所特有的一些氨基酸结构特征，如N末端具有一个17个氨基酸的信号肽；四个保守半胱氨酸残基；十四个氨基酸保守基序；前300个氨基酸的～些保守的基序以及C末端的5个串连的重复区域等。(2)东方巴贝斯虫RAPl原核表达、免疫定位及免疫反应原性根据RAPl基因的序列结构特点，其主要的预测功能位点都处在N末端的前三百个氨基酸内，本研究将克隆的东方巴贝斯虫RAPl开放阅读框全长(RAPl一F)和N末端834bp片段(RAP-N)连接到原核表达载体p

5、GEX．KG，成功的构建了原核表‘华中农业大学2012届硕士研究生学位论文达质粒pGEX．KG．RAPl．F和pGEX．KG．RAPl-N。利用原核表达所得的重组蛋白GST-RAPl．F和GST-RAPl-N免疫新西兰白兔成功的制备了多克隆抗体。利用东方巴贝斯虫感染水牛阳性血清的Western—blot分析表明，GST．融廿1．F和GST-RAPl-N都具有良好的反应原性。间接免疫荧光实验证明东方巴贝斯虫RAPl定位在红细胞内的虫体表面。本实验成功的克隆了东方巴贝斯虫RAPl基因，其基因序列与结构预测分析为进一步证明东方巴贝斯虫为独立新种提供了有力的依据；免疫荧光定位

6、实验初步证实东方巴贝斯虫RAPl也与虫体入侵宿主红细胞相关；原核表达的结果为我们预防控制东方巴贝斯虫病提供了一定的理论基础。关键词：东方巴贝斯虫；棒状体相关蛋白l；原核表达；免疫荧光定位；免疫反应原性东方巴贝斯虫棒状体相关蛋白1(RAPl)基因克隆及免疫特性研究AbstractBabesiaorientalis，whichistransmittedbyRhipicephalushaemaphysaloides，mainlycausesdiseaseinthebuffaloes．Theclinicalsymptomsarefever,anemia,jaundice，we

7、ightloss，hemoglobinuriaandevenmortality．Therearemorethan20yearssinceBabesia(B．)orientaliswasfirstlyreported，anditsmorphology,epidemiology,lifecycle，molecularclassificationhavebeencarriedoutanddiseasediagnosismethodshavebeendeveloped．Buttherearestillblanksintheinvasionmechanismo