上皮分化脂肪干细胞复合bamg重建组织工程尿道的实验研究

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1、上海交通大学博士学位论文上皮分化脂肪干细胞复合BAMG重建组织工程尿道的实验研究姓名：李鸿宾申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：徐月敏201204上海交通大学博士学位论文上皮分化脂肪千细胞复合BAMG重建组织工程尿道的实验研究摘要由于缺乏合适的替代材料，泌尿道重建一直是临床上寻找解决的棘手问题。尿道狭窄多由外伤、炎症、尿道下裂及肿瘤等原因引起，以往多采用膀胱黏膜、包皮皮瓣、口腔黏膜等自体组织进行修复，但由于存在供区损伤，材源有限，易导致感染、尿瘘、尿道再狭窄等并发症，研究者尝试利用组织工程上皮复合材料进行重建。但上皮细胞存在体外培养、扩增易

2、老化，无法达到复合回植所需细胞量，限制了其在临床上的应用。脂肪干细胞具有自我更新及定向分化潜能，且材源丰富，取材创伤小，为组织工程尿道重建研究的种子细胞选择提供了一种新的思路及可能。本实验尝试体外诱导兔模型脂肪干细胞向上皮细胞方向分化，经BrdU标记后与膀胱脱细胞基质复合，并探讨其应用于组织工程尿道重建的可行性，为脂肪干细胞今后在尿道重建研究中的运用提供实验依据。第一章脂肪干细胞(ASCs)l驹体外培养l目的探讨兔脂肪干细胞的分离，体外培养、扩增及鉴定方法。2材料和方法应用I型胶原酶消化法分离培养兔脂肪干细胞，获得脂肪干细胞后运用Hoechst

3、33258染色法分析细胞生长增殖特性。利用免疫荧光对脂肪干细胞表面蛋白进行鉴定。用流式细胞仪检测细胞表面标志(CDl3，CD29，CD31，CD44，CD45，CD49d，CD90，CDl05)。3结果原代培养3d后可见ADSCs贴壁生长，约7-9天左右可传代培养。镜下观察辔上海交通大学博士学位论文ADSCs贴壁后绝大多数为类成纤维细胞样长梭形形态，少数有突起，细胞相互之间以细丝拉网。培养细胞Hoechst33258染色法显示细胞指数增长期为5．7天，随后进入平台期。免疫荧光检测示a-SMA阳性，Vimontin，毋'tokeratin19，及

4、HLA-DR均为阴性。流式细胞仪检测结果CDl3、CD90、CD44、CDl05、CD29表达阳性，CD49d表达弱阳性，CD31、CD45表达阴性。4结论利用I型胶原酶消化法可获得纯度较高的脂肪干细胞，材源广泛，取材简单，创伤小。体外培养条件下细胞能保持稳定的群体倍数增长，且细胞衰老率达到最低。脂肪干细胞形态与成纤维细胞形态相似，且缺乏特异性的标记蛋白。当前研究中，我们根据以往经验，采用流式细胞技术对脂肪干细胞的表面标记分子进行检测，并结合形态学特性，及增殖特性进行鉴定，判断为兔来源脂肪干细胞，以用于组织工程尿道重建的研究。第二章脂肪干细胞体

5、外向上皮方向分化的研究l目的探讨兔脂肪干细胞在体外诱导条件下向上皮细胞分化的可能性。2材料和方法通过体外以包括ATRA，EcoF,HGF,KGF，及hydrocortisone诱导剂结合液气平培养模式(air-liquidinterfaceculture，Ⅲculture)建立3D诱导体系，通过不同条件设立诱导组及对照组，进行体外ADSCs向上皮方向诱导。诱导12天后，通过免疫荧光检测、Westernblot检测、流式细胞检测、Real．timePCR检测评价诱导结果，并通过透射电镜检测，及Hoechst33258染色法评价诱导后细胞形态及增殖

6、活性。3结果经过12天诱导，在最佳条件诱导组(2．50MA11R,A，20ng／mlEGF,10ng／mlKGF,10ng／mlHGF,andO．5p幽_IllhydrocortisoneinALIculture)，细胞出现类上皮6上海交通大学博士学位论文样复层细胞形态，并通过蛋白水平及基因水平检测显示上皮早期分化标记aytokeratin19表达阳性，粘膜上皮分化标记eytokeratin13表达弱阳性，间充质细胞标记anti．a-SMA表达下降，但上皮终末分化标记involucrin表达阴性。4结论实验证明，ASCs在合适体外诱导环境下，能

7、够向上皮细胞方向分化，出现相应形态学上改变及上皮分化蛋白的表达。对于当前在尿道组织工程研究中，上皮细胞存在的体外扩增困难，易老化的缺陷，提供了一种可行的解决方法；并为本实验进一步的开展，将上皮分化ASCs应用于尿道重建的研究提供了实验依据。1目的第三章脂肪千细胞的体9bBrtiU标记尝试BrdU体外标记脂肪干细胞，以示踪回植术后植入细胞在体内环境下的分化与转归。2材料和方法诱导后，及未诱导脂肪干细胞，在基础培养液中培养至细胞达70％融合，以15umol／L5-bromo．2'-deoxyuridine03rdU)的基础培养液继续培养48小时。培

8、养后细胞分别以免疫荧光检测、Hoechst33258染色法评价BrdU标记效果，及标记后细胞增殖活性改变情况。3结果经过48小时体外孵化标记，免疫荧光