fbln5-rpe对amd脉络膜新生血管的阴抑作用及其机制研究

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1、第三军医大学博士学位论文Fbln5--RPE对AMD脉络膜新生血管的阴抑作用及其机制研究*姓名：李付亮申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：阴正勤201205第三军医大学博士学位论文Fbln5一RPE对AMD脉络膜新生血管的阻抑作用及其机制研究摘要背景和目的老年黄斑病变(age—relatedmaculardegeneration，AMD)是全球范围内导致不可逆视力损伤的最常见原因，其中湿性AMD为国内外50岁以上人群低视力和致盲的重要原因，发病率不断增加。脉络膜新生血管(choroidaln

2、eovascularazition，CNV)形成是其危害视功能的主要病理基础和首要原因。在触发CNV的机制中，VEGF与抗血管生成因子之间的失衡尤为重要。VEGF是一种分泌性蛋白质，它可诱发血管生成，增加血管渗透性，引发炎症，而这些因素又与湿性AMD的发展进程密切相关。因此，众多学者在开发湿性AMD治疗药物时，都将VEGF当作潜在的治疗靶标，比如以适配子或者抗VEGF抗体片段形式出现的哌格太尼、兰尼单抗、Avastin等。而这些方法存在的问题主要包括不能在患部长效存在，即使应用各种缓释技术，由于

3、局部微环境病理性VEGF长时间分泌，因此仍无法满足抑制VEGF的需求；尤为重要的是这些药物与VEGF结合后，由于代谢的困难，存在加重drusen的危险，所以抑制VEGF的产生将比降解或拮抗它更有利于AMD的治疗。同时脂褐质过载的RPE细胞功能障碍始终是AMD的一个重要的不利因素，在CNV的形成和发展中起着重要的作用。Bruch’S膜的粗糙，弹力纤维层变薄甚至断裂，RPE和Bruch’S膜粘附力下降，为CNV的生长提供了有利条件和促进因素，或者是诱因之一。因此，虽然目前血管内皮生长因子(vascu

4、larenthothelialgrowthfactor，VEGF)抗体和光动力疗法等对CNV具有短期疗效，但对视功能恢复作用甚微。目前尚无能同时有效阻抑CNV和修复脉络膜一Bruch’S．RPE膜复合体的治疗措施。作为一种多功能的细胞外基质蛋白，Fibulin5(Fbln5)基因在AMD病程发展中，尤其在CNV形成过程中发挥重要作用。首先，在体内可调节细胞生长、运动及粘附，并且具有明显抑制新生血管的作用，虽然目前不能完全了解其对抗新生血管形成及VEGF作用的机制，但许多体内和体外研究证实了FBL

5、N5可以从多个环节中对抗新生血管的形成，并且是通过RGD基序起作用的抑制新生血管形成的机理。其次，FBLN5能防止弹性蛋白病变的发生，同时充当载脂蛋白A和整合素的配体，FBLN5可通过钙7第三军医大学博士学位论文依赖结合弹性蛋白的方式，促进弹性纤维组装并结合到微纤维系统中。FBLN5缺乏时由于深部弹力纤维结构的破坏，可引起皮肤、肺和脉管系统显著的异常。FBLN5的这两个重要作用恰好可以用来从不同环节抑制CNV，已有研究表明在眼部FBLN5可由RPE分泌，参与Bruch’S膜及部分玻璃膜疣的组装。

6、另外，有系列研究发现在Fbln5基因突变与AMD具有相关性，并认为是其致病基因之一。Fbln5的突变改变了与弹性蛋白原的连接特性，可能导致Bruch’S膜正常弹性纤维的组装及稳定性异常；同时Fbln5的突变干扰了RPE与Bruch’S膜的正常粘附关系，这与AMD的血管模型的发病机制相符。因此，本课题假设：过表达FBLN5的RPE(Fbln5一RPE)视网膜下移植既能抑带i]VEGF产生又能补充RPE修复脉络膜一Bruch’S—RPE膜复合体，可能是治疗AMD的新手段。本研究内容是构建Fbln5慢

7、病毒表达载体并转染RPE；体外检测其对脉络膜血管内皮细胞(CoroidalEndothelialCells)增殖、迁移功能的影响及分子机制；将Fbln5一RPE移植到CNV动物模型的视网膜下腔，通过手术前后眼底血管荧光造影检测研究对CNV的抑制作用，由此，探讨RPE转染Fbln5后移植治疗CNV的效果和作用机制。研究方法1．应用RatFbln5全长cDNA质粒(pExpress一1一Fbln5)，构建pZlen—Fbln5一IRES—GFP慢病毒表达载体，转染原代培养LongEvans(LE)大

8、鼠RPE，采用Quantitativereal．timePCR(Q—PCR)方法，从基因水平检测慢病毒FBLN5的过表达。提取培养上清液，进行FBLN5的Western—Blot检测，检测分析所构建慢病毒FBLN5过表达和分泌至细胞外的能力。2．Fbln5．RPE对CECs增殖和迁移抑制作用及其机制的研究，实验分为三组，即单纯RPE组(空白对照)、GFP空载转染RPE(GFP．RPE)组(阴性对照)和Fbln5。RPE组(实验组)。采用Transwell共培养体系将上述三种RPE细胞分别与RF／