bufalin在食管癌细胞中对mmp-2、mmp-9及mek信号通路的作用机制研究

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1、河北医科大学硕士学位论文Bufalin在食管癌细胞中对MMP--2、MMP--9及MEK信号通路的作用机制研究姓名：韩金薇申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：王小玲；刘月平201203中文摘要Bu"l：alin在食管癌细胞中对MMP-2、MMP-9及MEK信号通路的作用机制研究摘要目的：我国是食管癌的高发国家，根据调查研究显示，食管癌死亡率仅次于肺癌、胃癌、肝癌，居全国第4位。肿瘤的发生、发展是物理、化学、生物等环境因素与遗传因素共同作用的结果，是一个多因素、多阶段、累积渐进的过程。而在

2、肿瘤细胞局部浸润、无限增殖及远处转移的背后，细胞信号转导异常与其表现出了一定的关系。因此进一步对与其相关的信号转导通路及临床抗肿瘤药物作用机制的研究，仍为食管癌治疗研究的目标。细胞外信号调节激酶(ERKI／2)是丝裂原活化蛋白激酶((mitogen．activatedproteinkinase，MAPK)家族中的重要成员之一，其中，Ras／Ra伽mRK是ERK信号转导通路的主要途径。而其中，MEK是ERK信号通路的关键蛋白，分为MEKl和MEK2两种亚型，其作用是磷酸化并激活下游底物ERK。MEKl／2

3、广泛存在于各种生物体中，在细胞癌变过程中发挥重要作用，其可被多种丝裂原信号及癌基因产物所激活从而成为P．MEKl／2，进而转导胞外信号至细胞核内，进一步参与调节细胞的增长、分化、凋亡等多种生理活动，并在细胞的恶性转化过程中发挥重要作用。国内外学者研究发现，基质金属蛋白酶(MMPS)是降解细胞外基质蛋白的最主要的蛋白水解酶，它在肿瘤的发生、发展过程中具有核心作用。大量研究表明，MMPS具有广泛的底物特异性，通过降解细胞外基质成分，促进肿瘤侵袭及转移，并且还可以通过新生血管生成等促进肿瘤的生长和扩散。其中，

4、MMP．2与MMP一9是基质金属蛋白酶家族中分布最广、研究较清楚的主要成员。研究发现，MMP．2、MMP．9在多种实体瘤中(包括肺癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、骨肉瘤、乳头状甲状腺癌)均呈现高表达。另有学者研究认为，在纤维肉瘤细胞HTl080中，抑制ERK磷酸化，MMP．2、MMP．9的表达进而受到抑制，表明MMP．2和MMP．9的表达依赖ERK信号通路中ERK的磷酸化。而本实验中MEK又为中文摘要ERK信号通路的重要成员。本实验通过研究不同药物浓度的Bufalin(0、10、25、50、100nmol／

5、L)作用于体外培养的食管癌细胞株(TE．13)后，并观察对MMP．2、MMP．9以及MEKl／2及其活化形式(P．MEKl／2)表达的影响，进一步探讨MEK信号通路与基质金属蛋白酶(MMPS)在食管癌发生中的相互作用关系，为MEK信号通路成为食管癌临床治疗的新靶点提供必要的实验依据。方法：常规培养的人食管癌细胞TE．13经不同浓度的Bufalin(蟾蜍灵)进行处理后，通过MTT方法检测细胞药物毒性，采用逆转录聚合酶链反应RT．PCR方法对细胞中MMP．2、MMP．9mRNA的表达进行分析，采用蛋白印记W

6、estern．blot及免疫细胞化学方法对食管癌细胞进行MEKl／2、P．MEKl／2蛋白的相对定量检测，分析药物作用后其表达水平的变化。统计分析采用SPSS13．0软件，数据采用单因素方差分析。结果：1MTT检测结果不同浓度的蟾蜍素(对照组，10nM／L，25nM／L，50nM／L，100nM／L，200nM／L，400nM／L，800nM／L)干预24h后平均OD值(O．991、0．869、O．735、0．561、0．499、0．371、0．265、0．258)，蟾蜍素在100nM／L及其以下的药物

7、浓度作用下，细胞存活率大于50％，即TDo为100nM／L。2RT．PCR结果显示：MMP．2mRNA的表达量在食管癌细胞TE．13中随着Bufalin药物浓度的升高而逐渐降低，100nmol／L时表达量最低。相对表达量对照组为(0．772±0．010)，10、25、50、100nmol／L分别为(O．725±0．019、0．663±0．015、O．519±0．019、0．582-4-0．019)，各浓度与对照组相比，差异具有显著的统计学意义(P

8、药物浓度的升高而呈现逐渐降低的趋势，并且100nmol／L时表达量最低。相对表达量对照组为(0．783±O．013)，10、25、50、100nmol／L分别为(O．740±0．010、0．703±0．006、O．531-4-0．010、0．6014-0．017)，与对照组相比，差异具有显著的统计学意义(P<0．05)，结果与MMP．2mRNA相一致。3Western-blot结果显示：MEKl／2的表达量随着Bufalin浓度的升高没有显