载脂蛋白e及其模拟肽对细菌感染性疾病诊断和治疗作用及机制研究

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1、复旦大学博士学位论文载脂蛋白E及其模拟肽对细菌感染性疾病诊断和治疗作用及机制研究姓名：王传清申请学位级别：博士专业：儿科学指导教师：杨毅2012-04-05复旦大学博士论文博士学位论文中文摘要载脂蛋白E及其模拟肽对感染性疾病的诊断和治疗作用及机制研究研究目的1．研究血清及脑脊液(CSF)载脂蛋白E(ApoE)浓度测定对细菌性脓毒血症和细菌性脑膜炎的诊断价值。2．通过体外细胞培养和动物实验，研究自主设计的ApoE模拟肽(ApoE23)的抗菌作用及其机制，为其作为新型抗菌药物和免疫调节剂的潜在临床应用提供实验依据。研究方法1．将临床已明确诊断的细菌性脑膜炎、病毒

2、性脑膜炎、细菌性脓毒症患儿纳入研究，以非感染患儿为对照。除常规实验室检验指标(外周血白细胞计数、CRP、CSF常规及生化。CSF及血液细菌培养鉴定、CSF肺炎链球菌抗原检测和革兰染色、CSF肠道病毒RNA定量PCR检测)外，采用透射免疫比浊法测定研究对象的CSF及血清ApoE浓度，采用ROC曲线分析确定诊断界值(CUT—OFF)，评价ApoE浓度测定对儿童侵袭性细菌感染的诊断价值。2．自主设计ApoE模拟肽ApoE23序列，采用固相合成法合成，高效液相色谱法(HPLC)纯化，质谱及电喷雾质谱对合成肽纯度、氨基酸残基组成及分子量进行测定，圆二色谱技术结合K3D

3、3软件进行合成肽二级结构分析。通过Q螺旋轮法检测其亲水氨基酸残基及疏水氨基酸残基分布特点。3．ApoE23抗菌活性采用体外杀菌试验。4．采用体外细胞培养技术、酶联免疫吸附法(ELISA)、及定量PCR法检测ApoE23对LPS诱导的THP一1细胞(人单核细胞株)及人外周血单个核细胞(PBMC)的TNF-a、IL-6、IL一10表达的调节作用。5．采用B组鼠伤寒沙门菌脓毒血症小鼠模型研究ApoE23静脉注射治疗对脓毒血症小鼠死亡率影响，通过对脓毒血症小鼠脾脏细菌负荷测定、血浆LPS、TNF—a、IL一6测定及对脾脏、肺脏、肝脏及小肠形态或病理切片分析了解Apo

4、E23抗脓毒血症机理。研究结果1、共有185例患儿入组，其中细菌性脑膜炎患者26例，病毒性脑膜炎患儿32例，细菌性脓毒血症36例，对照组91例，年龄范围为1月～13岁。细菌性脑膜炎患儿脑脊液ApoE浓度与对照组相比明显增高，而病毒性脑膜炎、脓毒血复旦大学博士论文症患儿脑脊液ApoE仅轻微升高。当脑脊液ApoE浓度cut-off值为1．7)mg／L，其诊断细菌性脑膜炎的敏感度、特异度、分别为0．85(95％CI，0．71—1)、1(95％CI，0．89—1)，诊断价值高于脑脊液WBC计数、脑脊液总蛋白、葡萄糖及氯化物。当血清ApoE浓度cut—off值为42．

5、O>mg／L，其诊断细菌性脓毒血症的敏感度、特异度分别为0．80(95％CI，0．64-0．89)、0．93(95％CI，0．88-0．97)，诊断价值高于外周血CRP及WBC计数。2、自主设计的ApoE23二级结构Q螺旋比例为21．6％，且为两亲性螺旋，较国外同类肽具有更好的组织细胞穿透性。3、ApoE23对革兰阴性杆菌有明显抗菌活性，其MIC。。值为1～1．25umol／L，低于国外同类肽(ApoEdp)，对泛耐药鲍曼不动杆菌仍具有明显杀菌活性。ApoE23对革兰阳性葡萄球菌的杀菌活性低于革兰阴性杆菌，对肠球菌及对白色念珠无抗菌活性。4、ApoE23具有

6、显著下调LPS诱导的人PBMC及THP一1细胞TNF_a、IL-6mRNA及蛋白表达作用，下调THP-1IL-IOmRNA及蛋白表达作用、下调人PBMCIL一10蛋白表达。5、106CFU剂量B鼠伤寒沙门菌腹腔注射后24小时内，生理盐水治疗组小鼠死亡率为60％，ApoE23治疗组死亡率为0。ApoE治疗组小鼠体内细菌负荷、血浆TNF—a、IL一6、LPS浓度均低于生理盐水治疗组。ApoE23治疗组小鼠脾脏、肺脏、肝脏及小肠的炎性改变程度明显低于生理盐水治疗组。结论1、CSF和血清ApoE浓度测定可作为儿童侵袭性细菌感染的快速诊断指标，具有良好的特异性和敏感性

7、。2、自主设计的ApoE23抗菌谱窄，可抗胞内寄生菌及泛耐药菌，MIC∞低，抗菌活性和组织穿透性优于国外同类肽，具有优质抗菌药物特性。3、ApoE23对LPS诱导的体外培养免疫细胞的应答反应具有调节作用。4、ApoE23具有的抗菌及免疫调节双重功能，可显著降低脓毒血症小鼠死亡率，是潜在的脓毒血症治疗药物。关键词：ApoEApoE模拟肽侵袭性细菌感染诊断治疗中图分类号：R446．62；R725．14复旦大学博士论文TherolesandmechanisminvestigationofapolipoproteinEandapolipoproteinEmimeti

8、cpeptideApoE23inthediagnos