杂色鲍血蓝蛋白功能肽段的多样性及absv感染后血浆的差异蛋白质研究

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1、上海海洋大学硕士学位论文杂色鲍血蓝蛋白功能肽段的多样性及AbSV感染后血浆的差异蛋白质研究专业名称：临床兽医学作者姓名：韩焘指导老师：王江勇上海海洋大学硕士学位论文杂色鲍血蓝蛋白功能肽段的多样性及AbSV感染后血浆的差异蛋白质研究摘要鲍属于软体动物门（Mollusca）、腹足纲（Gastropoda）、前鳃亚纲（Prosobranchia）、鲍科（Haliotiidae）。鲍被称为海产八珍之首，肉质鲜美、营养丰富，是中华民族的传统珍馐佳肴，此外鲍还具有很高的药用价值。杂色鲍（Haliotisdiversicolor）是我国南方重要的鲍养殖品种。近年来鲍养殖业急

2、速膨胀，养殖环境日益恶化，鲍病害呈现爆发性的增长趋势，对鲍养殖业造成了极大损害。例如，鲍肌肉萎缩症病毒（abaloneshrivelingsyndrome-associatedvirus，AbSV）从发现至今，每逢冬季、春季反复暴发，且每次都是毁灭性的，该病毒不归于已知病毒种类，病毒形态尚未确定，基因结构特殊，不编码外壳蛋白。随着病毒等病害的增长，如何防治鲍病害已经引起了相关科研人员及养殖业者的高度重视，而提高免疫力无疑是鲍健康养殖的一条最根本和行之有效的方法。然而，从分子水平上对其先天免疫系统以及免疫因子的研究还十分有限，客观上限制了鲍病害防控技术的发展。血蓝蛋白具有多样的

3、免疫功能，在以完整的蛋白分子发挥免疫作用的同时，还能降解成更小的肽段行使功能，本研究以杂色鲍血淋巴为材料利用双向电泳和Western杂交对蛋白质组和血蓝蛋白（Hemocyanin）进行研究，为深入开展鲍的分子免疫研究打下良好基础。本研究以鲍血淋巴为材料建立可与质谱兼容的双向电泳技术体系。首先，确定了以丙酮沉淀法和RCDC蛋白定量试剂盒为基础的蛋白制备与定量方法；其次对样品前处理方法进行了摸索，通过500r/min的低速离心方法分离了血细胞和血浆组分，通过35000r/min超速离心2h除掉了部分高丰度的血蓝蛋白，降低了高分子量区域的血蓝蛋白背景；进一步使用18cmpH3-10

4、非线性胶条和优化后的电泳程序，对不同上样量的电泳结果进行了比较，可获得良好的双向电泳图谱；最终对其中4个蛋白点进行了质谱鉴定，分别为肌动蛋白、原肌球蛋白、胶原蛋白和血蓝蛋白。鲍血淋巴双向电泳技术的建立为后续的鲍差异及功能蛋白质组学研究提供了技术保障。本研究利用双向电泳与Western结合的方法获得血蓝蛋白大量的功能肽段。在上海海洋大学硕士学位论文业已建立的双向电泳研究方法基础上，本研究对杂色鲍血淋巴总蛋白进行了双向电泳分离，进一步使用亲和纯化制备的高效价血蓝蛋白多克隆抗体进行了Western检测（血淋巴总蛋白上样120µg，杂交一抗比例为1:20000，二抗比例为1:2000

5、0），获得了清晰的杂交斑点图。杂交得到数十个阳性蛋白点，主要集中在分子量40-100KDa、等电点5-8。对其中的24个点成功的进行了质谱鉴定，初步判断为血蓝蛋白7种不同的肽段。本研究获得AbSV感染后杂色鲍血浆总蛋白在5个不同时间点（0h、6h、12h、24h及72h）的差异表达，其中前4个时间点连续变化较为明显的差异蛋白点有20个，包括持续上升、先升后降、先降后升以及特殊点，而感染72h时差异蛋白点有63个。质谱鉴定结果包括肌动蛋白、原肌球蛋白和胶原蛋白等结构蛋白，以及果糖酶和血蓝蛋白等功能蛋白。这些信息的获得有助于人们了解贝类病毒病原的致病机理和宿主免疫机制，深入研究免

6、疫相关蛋白，并为病害防治提供有利依据。关键词：杂色鲍，血蓝蛋白，血淋巴，蛋白质组，双向电泳，鲍肌肉萎缩症病毒上海海洋大学硕士学位论文Identificationofthehemocyanin'sfunctionalpeptidesinabalone(Haliotisdiversicolor)andthedifferentialproteomeofbloodplasmaunderAbSVinfectionABSTRACTThetaxonomicpositionofabalone:Mollusca,Gastropoda,Prosobranchia,Haliotiidae.Abal

7、oneiscalledthebestseafood,sweet-meated,eutrophy,whichisthetraditionaldelicaciesofChina,furthermore,ithasveryhighmedicinalvalue.HaliotisdiversicoloristheimportantbreedingstockatthesouthofChina.Inrecentyears,abalonebleedingrapidlyexpanding,breedingenvironm