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1、枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶发酵的研究（董祖明生物工程091指导老师：焦扬老师）（农业与生物技术学院，甘肃张掖734000）摘要：对枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶的培养基成分及培养条件进行优化，在单因素基础上通过正交实验确定发酵培养基各成分最佳配比，采用优化培养基对发酵菌株的培养条件进行单因素实验。结果表明：最佳发酵培养基为：葡萄糖10g/l、麦芽糊精20g/l、柠檬酸钠3g/l、CaCl23g/l、KH2PO10g/l、FeSO40.5g/l最适发酵条件为:接种量3.5%、装液量50mL/250mL、溶氧50.5%、32℃,发酵36h,
2、在最佳培养条件下碱性蛋白酶酶活可达507.53U/ml关键词：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶发酵培养基引言：碱性蛋白酶是指在pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类,其最适pH值一般为9～11,属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类,除可催化蛋白质水解为氨基酸外,在有机溶剂中还可催化多肽的合成[1]。它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用,吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究[2]。微生物蛋白酶均为胞外酶,与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快
3、速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,同时易于实现工业化生产[3]。我国研究和生产的碱性蛋白酶的活力水平虽然不断提高,但大多数采用进口的碱性蛋白酶制剂,并且大规模工业生产中用的碱性蛋白酶还是主要依赖进口[4]。枯草芽孢杆菌是生产碱性蛋白酶的传统菌株,具有产蛋白酶量大,耐高温、高碱等特点,因此对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点[5]。本研究通过正交试验对枯草芽孢杆菌发酵培养基及培养条件进行优化,以期进一步提高枯草芽孢杆菌所产碱性蛋白酶粗酶的活力。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种:枯草芽孢杆菌（发酵试验室培养）1
4、.1.2试剂:酪氨酸福林试剂0.4mol/l三氯乙酸0.4mol/l碳酸钠溶液干酪素亚硫酸钠溶液标准缓冲液（PH6.86）1.1.3培养基种子培养基：胰蛋白胨5g/l酵母浸粉5g/l葡萄糖10g/lKH2PO418g/l121℃蒸气灭菌20min。摇瓶培养基：酵母浸粉0.875g/l麦芽糊精5g/l柠檬酸钠0.15g/lKCl0.46g/lCaCl20.15g/lK2HPO40.5g/lpH值自然，121℃蒸气灭菌20min。发酵培养基：葡萄糖10g/l麦芽糊精20g/l柠檬酸钠3g/lCaCl23g/lKH2PO10g/lFe
5、SO40.5g/lPH值自然，121℃蒸气灭菌20min。1.1.4器材：自动式发酵罐高压灭菌锅超净工作台电热恒温水浴锅低温离心机分光光度计PH计1.2方法1.2.1碱性蛋白酶活力的测定取碱性蛋白酶菌种发酵液于离心管内，4000r/min离心20min取上清液,采用Folin酚法测定碱性蛋白酶活力酶活力[5]。酶活力单位定义为：在温度55℃pH10.0的条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸所需酶量定义为1个酶活力单位，以U表示。A680*K*n*4样品的酶活力(U/ml)＝———————————10式中：A--样品平行实验的
6、平均吸光度K--吸光常数4--反应试剂的总体积(ml)10--反应时间(min)n--稀释倍数1.2.2不同无机盐对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶粗酶的影响无机盐分别选用0.02%Na2HPO4、0.02%KCl、0.02%K2HPO4、0.02%NaCl，以不加无机盐为对照组，在其他条件不变的情况下，以酶活力为指标，确定最佳无机盐。1.2.3发酵罐发酵1.2.3.1种子培养：在无菌条件下自斜面菌种一环菌体，接入装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，在32℃振荡培养12-16h。1.2.3.2发酵前的准备：发酵培养基的配制，
7、电极的标定及发酵罐的实消1.2.3.3接种：将浸有酒精的脱脂棉围绕在接种口周围，点火打开接种口，将种子培养液注入。接种量为3.5%，盖好接种口，调节搅拌转速至所需数值，培养开始。1.2.3.4发酵过程控制：控制过程基本参数的记录（种子液OD600，PH,Do,温度），发酵过程直接参数记录（PH,Do,温度，转速）及离线参数记录（OD600，酶活，PH值）1.2.3.5粗酶液分离：继续发酵后将发酵液离心（3500r/min，15min）收集上清液保存，收集离心沉淀进行灭菌处理。1.2.3.6清洗发酵罐，空消，结束发酵过程。2结果与
8、分析2.1碱性蛋白酶酶活力测定标准曲线碱性蛋白酶测定结果如图1所示。由该曲线求得线性回归方程为：Y=89.317X-2.048，R2=0.9935。本法在酪氨酸浓度0～60μg/ml范围内有良好的线性关系。2.2不同无机盐对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶粗酶酶活力
