衣阿华支原体与滑液支原体的全基因组测序及分析

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1、华中农业大学博士学位论文衣阿华支原体与滑液支原体的全基因组测序及分析姓名：魏顺申请学位级别：博士专业：基础兽医学指导教师：陈焕春201206衣阿华支原体与滑液支原体的全基因组测序及分析中文摘要衣阿华支原体(Mycoplasmaiowae)被称作一种非比寻常的支原体，它不仅对抗生素和热处理具有坚强的耐受力，对胆盐的抗性也与众不同，该支原体主要在火鸡养殖业中具有重要的经济意义，可以导致火鸡死胚。滑液支原体(Mycoplasmasynoviae)最早从患有滑膜炎的病鸡中分离，肉鸡和火鸡感染后均呈现为关节渗出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎，部分菌

2、株感染宿主后能引发慢性呼吸道疾病道症状，导致气囊受损。本研究采用Roche454GXFLX及配套软件对毒力较弱的衣阿华支原体695株和毒力较强的滑液支原体GXl1．T株进行测序与拼接工作，借助软件与数据库对基因组所承载的遗传信息进行了注释与分析，进而对这两株支原体的基因组结构、进化情况以及毒力岛等有了更为深入的理解。本研究对滑液支原体GXll．T株的遗传转化条件进行了摸索，利用电化转携带Tn4001转座子的质粒pMT85，成功筛选出滑液支原体GXll．T株中带有庆大霉素抗性基因的突变株，主要工作包括：1．衣阿华支原体695株基因组测序

3、及基本分析衣阿华支原体695株基因组全长1195，147bp，G+C含量20％，预测含有947个编码基因，编码基因的平均长度为1089bp，2个rRNA和29个tRNA。通过对衣阿华支原体的代谢通路、氨基酸使用频率及偏好性、信号转导系统、限制性修饰基因、假基因、蛋白质互作等方面进行了基本分析后，我们发现在已完成基因组序列的支原体属的菌株中，只有衣阿华支原体695具有糖酵解途径中的熊果苷和水杨苷的分支代谢途径。在衣阿华695株的信号转导系统中，我们发现了一对位于编码热休克蛋白的基因上游编码了双组份信号转导系统组分的蛋白：组氨酸激酶(69

4、5．orfD285)和信号转导调控因子(695．orf0477)，并软件预测该信号转导调控因子能够与DnaK发生蛋白质互作，因而我们推测DnaK．DnaJ．GrpE热休克系统可能受其上游这个双组份信号转导系统的调控，并与衣阿华支原体695株的耐热性相关。此外，该基因组中发现了一个和代谢胆盐相关蛋白UvrA57％氨基酸同源的核酸外切酶(695．orf0053)，暗示了其可能与衣阿华支原体抗胆盐能力相关。2．滑液支原体GXll．T株基因组测序及基本分析1华中农业大学2012届博士学位论文完成了滑液支原体GXll．T株基因组的测序及分析。滑

5、液支原体GXll．T株基因组全长738，351bp，G+C含量为28．34％，预测含有679个编码基因，其平均长度为981bp，含有2个rRNA，32个tRNA。同样我们对其代谢通路、氨基酸使用情况、信号转导系统、限制性修饰基因、假基因、蛋白质互作等方面进行了分析。在滑液支原体GXll．T株中假基因的预测数目有34个，其中有5个编码VllA黏附素基因家族蛋白。而滑液支原体GXll一T株预测的7个毒力岛中，有一个基因岛主要编码与侵袭力直接相关的VlhA黏附素基因家族蛋白，从基因组学水平上解释了滑液支原体GXl1．T的较强毒力。3．进化与

6、蛋白质聚类分析本研究挑选了已经完成基因组测序的支原体属中的20株支原体的基因组为参考基因组，完成了对衣阿华695株和GXl1．T株进化分析，基于16srDNA和加】，基因的进化结果分析显示衣阿华支原体695株与鸡毒支原体亲缘关系较近，而滑液支原体与牛支原体亲缘关系较近，并和猪肺炎支原体、猪鼻支原体同属一个分支。通过比较滑液支原体GXl1．T基因组序列和已被公布的滑液支原体53株基因组序列，两株支原体中约有90％的基因高度相似，其中有8个是滑液支原体GXl1．T株特有基因，包括一个属于VIhA黏附素基因家族蛋白编码血凝素蛋白(GA．or

7、f0438)，与相位移动相关。此外，对包括衣阿华支原体695株、滑液支原体GXll．T株的3株鸡源支原体进行基因家族聚类分析，结果显示衣阿华支原体695株具有43个特有基因家族，而滑液支原体GXl1-T株具有87个特有基因家族。4．滑液支原体遗传转化的探讨本研究将含有Tn4001转座子的质粒电转化到滑液支原体GXll—T株中，优化了滑液支原体的遗传转化条件，探讨了不同电场强度、电阻大小、质粒浓度等条件对滑液支原体的电转化效率的影响，并获得了5株稳定遗传的带有庆大霉素抗性基因的稳定遗传突变株。关键词：滑液支原体，衣阿华支原体，基因组测序

8、，进化分析；支原体遗传转化；2衣阿华支原体与滑液支原体的全基因组测序及分析AbstractMycoplasmaiowaeisconsideredtobeanspecialMycoplasma，characterizedb