新型纳米载体的构建及其在经皮免疫中的应用

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1、浙江大学硕士学位论文新型纳米载体的构建及其在经皮免疫中的应用姓名：李旎申请学位级别：硕士专业：药剂学指导教师：高建青20120307浙江大学硕士学位论文摘要目的：探讨以脂质体和纳米粒为载体的卵清蛋白经皮疫苗的制备方法及其对小鼠的免疫效果，以期作为有效的经皮疫苗载体用于抗肿瘤治疗。方法：1、采用逆向蒸发法和薄膜分散法制备了携载卵清蛋白(OVA)的柔性脂质体，以壳聚糖、三聚磷酸钠为材料运用离子凝胶化法制备了携载O凇的壳聚糖纳米粒，进行纳米制剂的形态、粒径与电位、体外释放等一系列表征；2、比较不同制备方法对经皮渗透的差异，考察不同类型脂质体制剂对药物经皮性能、在皮肤中的滞留及分布

2、的影响，评价制备工艺对脂质体与纳米粒所携载的卵清蛋白的影响，探讨两种纳米制剂的经皮途径；3、通过不同免疫佐剂的筛选，选择具有增强免疫效果的佐剂用于纳米制剂体内经皮免疫效果评价。4、以卵清蛋白为模型药物，通过测定血清中的抗OVA免疫球蛋白13(IgG)含量，对不同卵清蛋白制剂经皮免疫的效果进行评价，考察角质层分别对脂质体与纳米粒经皮效果的影响。5、通过考察朗格汉斯细胞识别摄取卵清蛋白壳聚糖纳米粒与迁移至周围淋巴结的能力，探索携载卵清蛋白的壳聚糖纳米粒诱导经皮免疫的发生机制。6、以优选的制剂为载体，构建黑色素瘤相关抗原gpl00抗肿瘤经皮疫苗，考察其免疫预防治．疗小鼠黑色素实体

3、瘤效果。结果：脂质体和纳米粒形态圆整，分布均匀，粒径分布在200～300nm范围内，柔性脂质体与壳聚糖纳米粒能有效地携载卵清蛋白并保持其不被降解，包裹了卵清蛋白的纳米制剂能穿透皮肤角质层并贮存于皮肤中形成储库，保持较高的药物浓度。通过对纳米制剂经皮机制的考察，携载了FITC．OVA的柔性脂质体与壳聚糖纳米粒进入皮肤的机制主要是通过皮肤附属器途径，包括毛囊，汗腺，皮脂腺等。携载了卵清蛋白的两种柔性脂质体与卵清蛋白壳聚糖纳米粒在经皮免疫后能产生较高的特异性抗OVA的IgG，成功引发小鼠的免疫应答。咪喹莫特作为合适的经皮免疫佐剂，能有效提高经皮疫苗的免疫效果。角质层的存在对卵清蛋

4、白柔性脂质体的体内经皮免疫不产生明显影响。相比两种柔性脂质体，壳聚糖纳米粒的体内免疫效果较强，但仍受角质层屏障作用所影响，在完整皮肤上，壳聚糖纳米粒的经皮免疫效果有所减弱。在进一步的研究中，考察壳聚糖纳米粒在经皮免疫的发生机制，通过免疫磁珠法制备了皮肤朗格汉斯细胞进而比较其摄取抗原的能Ⅱ浙江大学硕士学位论文力，相比FITC．OVA溶液组，FITC-OVA壳聚糖纳米粒更易被朗格汉斯细胞识别摄取，通过体内示踪实验观察得到携载了FITC．OVA的壳聚糖纳米粒相比单纯FITC．OVA溶液更易于被朗格汉斯细胞识别处理后迁移到周围淋巴结，从而行使抗原递呈功能。携载gpl00蛋白的壳聚糖

5、纳米粒经皮疫苗显示出一定的抑制小鼠黑色素实体瘤的效果并能提高荷瘤小鼠生存率。结论：通过柔性脂质体和壳聚糖纳米粒的携载，卵清蛋白能更好地被保护而不受降解。在经皮过程中，以纳米制剂为载体的药物更有效地通过皮肤附属器途径进入活性皮肤层，形成药物的贮库，逐渐扩散到周围皮肤。角质层的存在，对卵清蛋白柔性脂质体的体内经皮免疫效果不产生明显影响，克服了常规经皮疫苗时角质层存在阻滞经皮吸收的负面影响。携载卵清蛋白的壳聚糖纳米粒在经皮免疫后可促进小鼠体内免疫保护应答的产生，但仍在一定程度上受角质层屏障作用对经皮效率的影响。壳聚糖纳米粒疫苗相比脂质体疫苗可以产生更高的免疫效果。朗格汉斯细胞抗原

6、摄取提呈的改变与载体类别有关，携载了FITC．OVA的壳聚糖纳米粒能更好地被抗原递呈细胞识别摄取并迁移至周围淋巴结，有利于产生有效的经皮免疫应答。将壳聚糖纳米粒与优化的经皮佐剂结合后更有利于免疫应答的产生，使经皮疫苗免疫效果更佳。携载有肿瘤相关抗原的壳聚糖纳米粒经皮疫苗免疫治疗癌症具有较好的应用潜力。关键词：经皮疫苗；脂质体；纳米粒；朗格汉斯细胞；免疫增强；卵清蛋白；佐剂m浙江大学硕士学位论文AbstractObjective：Topreparetwotypesofflexibleliposomesandchitosannanoparticle，andtodetermine

7、theirefficaciesforthetranscutaneousdeliveryofantigenandtheimmuneresponseinducedinViVO,forfurtheranti-tumortherapyaseffectiveranscutaneousvaccines．Methods：1．ovalbumin(OVA)一liposomebasedtransculaneousvaccineswerepreparedwitllthemethodsofreversephaseevaporationan