斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因的扩增、测序,和cytb基因在斯氏狸殖吸虫不同虫期的表达

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1、中图分类号：R89；R36：R39硕士学位论文斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因的扩增、测序，和cytb基因在斯氏狸殖吸虫不同虫期的表达院（系）、所基础医学院研究生姓名王曼学科、专业免疫学导师姓名王光西教授二Ο一二年四月目录1论文正文斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因的扩增、测序，和cytb基因在斯氏狸殖吸虫不同虫期的表达1.1中文摘要1.2英文摘要1.3前言2实验一斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因片段的扩增、测序，并将其纳入NCBI基因库中。探讨斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因在吸虫分类方面的作用。材料与方法结果3实验二斯氏狸殖吸虫5个虫期c

2、DNA的获得。RealtimePCR法分析斯氏狸殖吸虫5个虫期线粒体cytb基因的表达情况并分析与其致病的关系。材料与方法结果4讨论5结论6参考文献7英文缩略词对照表8致谢9吸虫线粒体基因研究进展（综述）参考文献斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因的扩增、测序，和cytb基因在斯氏狸殖吸虫不同虫期的表达摘要目的：扩增出斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因片段并测序，研究斯氏狸殖吸虫5个虫期线粒体cytb基因的表达情况并分析对吸虫研究的作用。方法：（1）分别提取斯氏狸殖吸虫囊蚴、30天童虫、60天童虫、成虫、虫卵的mRNA，并反转录为cDNA保存

3、于-20℃。（2）用日本血吸虫线粒体cytb基因设计出斯氏狸殖吸虫的线粒体cytb基因的兼并引物，聚合酶链式反应（PCR）法扩增出斯氏狸殖吸虫cytb基因片段→电泳分离→提纯→连接→转化→挑菌→摇菌→送出测序。用所得的测序结果设计斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因片段的特异引物。（3）用DNAsis等软件分析7种吸虫的线粒体cytb基因，并用树的方式表达它们的亲缘关系。（4）以5个虫期cDNA为模板，特异引物为实验组引物，卫氏狸殖吸虫的18SrDNA基因引物作为内参引物做实时荧光定量PCR（realtimePCR）。根据所获得的结果判断

4、斯氏狸殖吸虫5个虫期线粒体cytb基因的表达情况并分析与不同虫期虫体致病情况的关系。结果：（1）获得542bp的斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因片段，并将该基因片段纳入NCBI基因库中。根据该基因片段设计出一对斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因片段的特异引物CytbF:5′GGTTGCTTGATCATAACATTGG3′CytbR:5′GACACTCTGGGTCGACCTTG5′(2)通过在Genebank数据库中Blast发现，斯氏狸殖吸虫的此段cytb序列与日本血吸虫（中国流行区虫种）、异盘并殖吸虫、哈氏并殖吸虫、卫氏并殖吸虫以及斜睾

5、吸虫等有相似性，一共搜索到种7具有同源性的虫种，对7种吸虫线粒体cytb序列利用MEGA4计算遗传距离，采用最大简约法（MP）和邻位相连法（NJ）构建系统进化树，Bootstrap法检验，并Clusterx软件对7种吸虫线粒体cytb序列进行多序列对比，用DNAsis软件对实验所得日本血吸虫和斯氏狸殖吸虫cytb片段序列进行序列分析，结果显示，用NJ和MP方法构建的遗传系统进化树拓扑结构相似，同时用MEGA4软件对遗传距离进行分析计算上，所得遗传距离远近分布与所得遗传系统进化树结果一致。RealtimePCR结果显示除了虫卵期不见线

6、粒体cytb基因的表达，其他虫期均有表达。结论：1.线粒体cytb基因可作为吸虫遗传进化分类的依据。2.线粒体cytb基因在斯氏狸殖吸虫不同虫期的表达情况与不同时期该虫对宿主的侵袭危害是成正相关的，也为以后的预防，诊断，治疗提供理论依据。关键词：斯氏狸殖吸虫；线粒体；cytb基因片段；T/A克隆；PCR；RT-PCR；DNAsis;RealtimePCRsequencemitochondriagenecytbofPagumogonimusskrjabiniandcytbexpressionindifferentstageAbstra

7、ct：Objective：前言肺吸虫病是由并殖吸虫(Paragonimus)引起的一种人畜共患的地方性寄生虫病，已报道并殖吸虫虫种近50种，包括同物异名、亚种及变种，其中32种是在我国报道，并证实可寄生人体的并殖吸虫就有9种。在东南亚、非洲与拉丁美洲均有流行，在我国就有25个省、市、自治区流行该病。斯氏并殖吸虫（Paragonimusskrjabini）是我国独有虫种，主要分布于四川、云南、贵州、福建等14个省、市、自治区。斯氏并殖吸虫的终末宿主为犬、猫、果子狸等，能在它们体内发育成成虫，成虫产卵，卵通过呼吸道排出，在水内孵化成毛蚴

8、，毛蚴钻入第一中间宿主淡水螺内发育成为尾蚴。尾蚴离开螺体后能在水中生存1-2天，如遇第二中间宿主淡水溪蟹或蝲蛄，侵入其体内发育成为囊蚴，囊蚴是肺吸虫的感染型。正常终末宿主吃下感染的溪蟹或蝲蛄，囊蚴随之进入消化道，经消化液作用脱囊成为童