喉癌端粒酶活性检测与其临床意义的分析

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1、室按常规方法培养并保存。1．2临床资料：47例喉癌组织新鲜标本取自1998年9月-2000年4月收住我科的47例原发性喉癌患者，经组织病理学确诊为喉鳞状细胞癌并行手术治疗。术前均未行化疗或放疗，同期取距肿瘤0．5cm及I．Ocm的癌旁组织标本21例。47例喉癌中男40例，女7例，年龄37-79岁，平均56．3岁，其中13例伴颈部淋巴结转移。肿瘤临床分期参照1992年UICC制定的喉癌TNM分类标准。其中I期7例，II期9例，Ⅲ期20例，Ⅳ期ll例。另选择喉乳头状瘤3例，喉角化症2例，其中男4例，女l例，年龄22—61岁，平均47．2岁。以声

2、带炎性息肉10例作对照，其中男6例，女4例，年龄20—53岁，平均35岁。47例喉鳞癌中，高分化鳞癌30例，中、低分化鳞癌17例，以上组织标本均在手术切取后1小时内置一80℃保存，待测。1．3端粒酶检测主要试剂：端粒酶检测试剂盒购于Boehringer～iannheim公司’1．3．1引物和探针：由美国Sangon公司合成。TS5'-AATCCGTCGAGcAGAGrT书’在5端标记生物素。CX5’—CCCTTACC(耵ACC(汀TA．CCCTTA-3’。探针5"-cOcT从CCcT从CC叽AA_3’，在5端标记地高辛。1．3．2POD标记

3、的抗地高辛抗体和T4932蛋白：为德国BoehringerMannh公司产品。1．3．3Taq酶：为美国Sangon公司产品，链霉亲合素为Sigma公司产品。1．3．4裂解液：iouol·L-1PMsF，lmol·L-1Tris(pH7．5)，1mol·L-1Mgcl2，lmmol·L～EGTA，0．5％cHASP，10％甘油。1．3．5PCR扩增应用液：2×底物缓冲液(TrisM啦12EelTween一20EGTABSA各2mmol·L。)，T4932蛋白1．0Ilmol·L一，dNTP0．4umol·L～。1．3．6杂交液：2×SSC，

4、20pmol生物素标记的探针，5llg·ml。鲑精DNA。1．3．7洗涤液：10mmol-L～Hepes—KOH，1．5mm01叱一'_Mgcl2，lOmmol叱qKCl，1mmol·L-IDDT。1．4仪器1．4．1PCR扩增仪4800型(美国PerkinElmer公司产品)。1．4．2酶标仪3022A型(华东电子仪器厂产品)。1．4．3C02培养箱(美国Heraeus与上海Lishen合资产品)。1．4．4—800C冰箱(日本东芝产品)。1．5方法1．5．1端粒酶提取液的制备：收集培养的细胞株或组织标本(约50mg)用生理盐水洗涤两次，

5、加裂解液200u1研磨、溶解细胞，冰浴30min，4℃120009离心20min，吸取上清液，保存于一80"C备用或直接检测。1．5．2端粒重复序列扩增(TRAP)：反应体系为50

6、I1，内含：2×底物缓冲液25p1，TS、CX引物各2ll1(100ng)，Taq酶1II1(2U)，TRAP模板2ul(或30-50ug总蛋白)，无菌DEPC水补至50

7、I1，无菌石蜡油40ul封盖。25Y：30min端粒酶合成端粒重复序列。94。C5min灭活端粒酶。然后进行PCR扩增：94。C30s，50。C30s，72℃90s，共30个循环，72℃延伸l

8、Omin。1．5．3ELlsA检测：l：50的链霉亲合素包被聚氯乙烯板，每孔50ul4℃过夜，次日用洗涤液洗涤4次，备用。取扩增产物5ul加变性液(0．5％NaOH)20ul室温变性lOmin，再加入225ul杂交液，充分混匀后，取100u1加至已包被的微孔板内，37。C杂交3h或4。C过夜；经洗涤液洗涤3次，再加POD标记的抗地高辛抗体100u1，37℃30min；洗涤5次，加底物缓冲液(含TMB)1001／1显色10、15min，以2mol·L。硫酸终止反应，在酶标伎上测A。50。、A6。。。直。1．5．4阳性结果判断：检测标本A450

9、．,-A690。值>O．2为阳性。1．6统计分析：用SPSS软件包9．0版本中的秩和检验进行统计分析。2结果2．1细胞株端粒酶活性检测结果：Hep-2细胞株端粒酶呈阳性，A值为2．799。2．2喉鳞癌与喉炎性息肉组织端粒酶活性：47例喉癌组织中，有39例端粒酶表达阳性，阳性率为83％(39／47)。而10例喉息肉组织端粒酶活性均为阴性。两者有极显著性差异(P

10、组织、癌前病变组织端粒酶活性比较木采用Mann—WhitneyTest法检验2．4喉癌及癌旁组织中端粒酶活性：21例癌旁组织中，6例癌旁0．5cm处的粘膜组织端粒酶呈阳性，但其活