降钙素基因相关肽基因导入对脑死亡大鼠的肺保护作用

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1、郑州大学博士学位论文降钙素基因相关肽基因导入对脑死亡大鼠的肺保护作用姓名：孙振涛申请学位级别：博士专业：麻醉学指导教师：韩雪萍201205中文摘要降钙素基因相关肽基因导入对脑死亡大鼠的肺保护作用博士研究生：孙振涛导师：韩雪萍教授郑州大学第一附属医院麻醉科河南省临床医学重点开放实验室郑州450052摘要脑死亡是指包括脑干在内的全脑机能丧失的不可逆性病理状态，脑死亡可导致肺损伤，肺损伤引起的氧合不足将直接影响到其他器官的功能和保护，探讨脑死亡肺损伤的机制，对预防和治疗脑死亡肺损伤具有重要意义。降钙素基因相关肽(Calcitoningene-relmedpeptide，CGRP)广泛存

2、在于神经系统、血管、肺脏等多种组织中，是一种具有血管舒张、心肌正性变力变时、肺保护、脑保护以及免疫调节作用等多种生物学功能的多肽。研究发现颅脑损伤后机体内CGRP含量发生改变，并且和颅脑损伤的严重程度相关，但脑死亡后CGRP的含量改变和脑死亡肺损伤发生发展的关系尚不明确。基于“脑死亡后机体CGRP含量发生改变，进而参与了脑死亡后肺损伤的发生和发展”的假设。本实验拟首先采用缓慢间断颅内加压法建立大鼠脑死亡模型，然后采用放射免疫法，RT．PCR，免疫印迹(Westernblot)等实验方法观察脑死亡不同时间点大鼠血浆CGRP及内皮素-1(Endothelin-1，ET．1)含量变化及

3、肺组织中CGRP的mRNA水平及蛋白表达，分析其与脑死亡后肺损伤的关系，探讨CGRP在脑死亡后的变化规律及其对脑死亡后肺损伤的影响与机制，为脑死亡后肺损伤的预防和治疗提供思路。进而在建立脑死亡模型时静脉给予外源一

4、生CORP，采用放射免疫法，酶联免疫吸附实验(Enzyme．1inkedImmunosorbentAssay,ELISA)，RT—PCR，Westernblot，免疫组织化学等实验方法观察CGRP对脑死亡大鼠血浆肿瘤坏死因子．a(Tumornecrosisfactor-a，州F．∞、白细胞介素-113(Interleukin．113，IL-lp)、白细胞介素．6(Int

5、erleukine．6，IL．6)等炎症因子水平及肺组织中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)活性的影响及对肺组中文摘要织丫-谷氨酰半胱氨酸合成酶(丫一glutamylcysteineSynthetase，1／-GCS)、水通道蛋白-1(AquaporinProtein-1，AQP·1)、CGRP的mRNA水平及蛋白表达的影响。同时观察静脉给予外源性CGRP后对肺组织形态的影响，探讨CGRP的肺保护作用及其可能机制。因为外源性CGRP在体内迅速灭活，代谢快、作用时间短，而构建CGRP重组腺病毒载体气

6、管导入具有不整合入宿主细胞基因组，安全方便，作用时间长等优点，理论上可对脑死亡肺损伤起到更好的保护作用。所以，拟在以上实验的基础上，通过气管导入带有增强型绿色荧光蛋白标记的降钙素基因相关肽重组腺病毒载体(Ad5．CGRP．EGFP)，然后观察CGRP基因转染后大鼠肺组织CGRPmRNA水平和蛋白表达水平及CGRP基因治疗对肺组织7-GCS，AQP．1等mRNA水平和蛋白表达的影响，对肺组织MDA含量、SOD活力，肺水含量、肺组织结构的影响，以及对血浆TNF．旺、IL．1B、IL．6含量的影响，并探讨CGRP基因治疗在脑死亡大鼠肺保护中的作用及机制。本研究拟观察脑死亡后CGRP的变

7、化规律及其和脑死亡肺损伤的关系，并通过CGRP基因导入观察CGRP基因治疗对脑死亡大鼠的肺保护作用并探讨其可能机制，为脑死亡肺损伤的预防及基因靶向治疗提供理论依据。本研究共分以下3个部分。第一部分脑死亡大鼠CGRP表达变化与脑死亡肺损伤1方法1．1健康Wistar大鼠20只，雌雄不限，体重250．3009，SPF级，将动物随机分为2组，即对照组(A组)、脑死亡组(B组)，每组10只。B组麻醉后行股动脉股静脉插管、气管插管及颅骨钻孔置管，硬脑膜外导管颅内缓慢加压建立脑死亡模型；A组麻醉后操作同B组，但不行硬脑膜外导管颅内加压。分别在麻醉后15min(TO)、脑死亡即刻(T1)、脑死

8、亡2h时点(T2)、脑死亡6h时点(T3)、脑死亡12h时点(T4)留取血液标本并于脑死亡12h时点留取肺组织标本。1．2采用放射免疫法分别检测不同时点血浆CGRP、ET-1含量变化。脑死亡12h时点留取肺组织，测定肺系数和肺水含量，苏木素．伊红(腿)染色观察肺脏组织结构变化。RT-PCR方法检测肺组织中CGRPmRNA；Westemblot方法测肺组织CGRP蛋白。中文摘要1．3统计学处理：所有数值变异均采用均数4-标准差(X±s)表示，应用SPSS16．0统计分析软件，采用重