脑梗死早期应用黄连素对缺血性脑组织的保护作用及对pakt、pgsk、pcreb和nf-κb调节作用的实验研究

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1、河北医科大学硕士学位论文脑梗死早期应用黄连素对缺血性脑组织的保护作用及对pAkt，pGSK，pCREB和NF--κB调节作用的实验研究姓名：张晓林申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：张祥建201203中文摘要脑梗死早期应用黄连素对缺血性脑组织的保护作用及对pAkt，pGSK．pCREB和NF．KB调节作用的实验研究摘要‘目的：脑血管病已成为我国居民死亡和成人残疾的首位原因，其中以缺血性脑血管病最为常见。缺血性脑血管病最初几天的继发性脑损伤常导致病情加重，损伤机制主要包括细胞炎症反应、线粒体功能异常、细胞毒性作用、氧化应激、细胞凋亡、Ca2+稳态失调等，这是一个复杂的病理级联反应，其

2、中以过度的炎症反应和细胞凋亡为主要原因，加速脑梗死缺血半暗带的细胞死亡。因此，如何减轻炎症反应和细胞凋亡成为治疗急性脑梗死的重要方法。Akt是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇。3羟基激酶(P13．K)下游的关键效应分子。P13。K／Akt通路是目前已知与神经细胞的存活相关最重要信号通路。Akt激活后可通过磷酸化作用灭活凋亡效应分子如糖原合成酶激酶3(GSK3)、又头转录因子、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9和BAD等从而促进细胞存活，具有抗脑缺血损伤作用，可提高脑组织抗缺血损伤的能力。P13．K／Akt通路激活后能够作用于下游多种激酶，其中包括CREB、GSK3。活化的CREB能调节促进

3、细胞的存活靶基因表达增加。最近研究证明激活P13．K／Akt通路还能直接抑制炎症反应。从而可以在促进存活和抑制炎症反应两方面降低急性脑缺血的继发性脑损伤。众多中药成分可以通过调节Akt活性起到脑保护的作用。黄连素(Berberine，BBR)是一种生物碱，在中国和印度临床上常用的的一种抗腹泻的中草药有效成分，近代研究显示黄连素具有广泛的生理作用，除了对心肌、脑血管和肝脏具有抗炎、抗氧化、降低血糖、调节代谢等作用以外，还具有抗肿瘤作用。黄连素是否可以起到脑保护作用，其作用机制如何均有待探索。本实验成功建立大鼠大脑中动脉闭塞模型，并运用此模型进行：①应用黄连素后，观察其对脑含水量、神经功能缺

4、损评分、脑梗死体积的影响，探索其脑保护作用；②应用黄连素后，测定缺血组织的phospho．Akt、phospho．GSK3p、phospho．CREB、claudin．5矛nNF．r．B的含量变化，从而探讨其与脑保护作用之间的关系，及黄连素脑保护作用的可能机制，为临床中文摘要治疗提供更为有利的理论依据。方法：实验分为两部分：实验一，黄连素的脑保护作用研究。实验二，黄连素治疗组的phospho．Akt、phospho．GSK313、phospho．CREB的含量变化。实验一：采用成年健康雄性Sprague．Dawley大鼠，随机分为假手术组(Sham)、单梗组(pMCAO)、黄连素小剂量(

5、10mg／kg)组(BBR-L)及黄连素大剂量(40mg／kg)组(BBR—H)。参照Longa等的线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉闭塞模型(middlecerebralarterywasoccluded，MCAO)。大脑中动脉阻塞术后立刻腹腔注射黄连素溶液(10mg／kg或40mg／kg)，并于术后24小时进行神经功能评分，完毕后将动物断头处死，留取病变侧脑组织进行干湿重法脑含水量测定，采用2％2，3，5．三苯基四唑氮红(triphenyltetrazoliumchloride，TTC)染色测定脑梗死体积。实验二：采用成年健康雄性Sprague．Dawley大鼠，随机分为假手术组(Sham

6、)、单梗组(pMCAO)、黄连素小剂量(10mg／kg)组(BBR—L)及黄连素大剂量(40mg／kg)组(BBR-H)。采用免疫组织化学、蛋白印迹法(WesternBlot方法)和半定量逆转录多聚酶链反应法(RT．PCR方法)分别测定phospho-Akt、phospho·GSK313、phospho-CREB、claudin-5和NF—rd3的表达情况。结果：1．享申经功能评分：实验一中，MCAO后24h采用改良的6分法进行神经功能行为学评分。与pMCAO组相比BBR-L组和BBR-H组神经功能症状缺损均有明显改善(均为尸

7、1．31％，pMCAO组为84．35-4-1．69％，与其相比，黄连素治疗组脑组织含水量降低并具有统计学差异(pMCAOVS．BBR—L，84．354-1．69％VS．82．444-1．83％；pMCAOVS．BBR—H，84．354-1．69％VS．81．844-1．91％)(尸<0．05)。3．梗死体积(％甩V)的测定：与单梗组(％眦V：44．174-7．44％)相比，黄连素治疗组明显降低了梗死体积(BBR-L％HLV．34．7