硫酸岩藻聚糖和寡糖结构分析、糖芯片的构建及其与流感病毒神经氨酸酶作用研究

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1、硫酸岩藻聚糖和寡糖结构分析、糖芯片的构建及其与流感病毒神经氨酸酶作用研究硫酸岩藻聚糖和寡糖结构分析、糖芯片的构建及其与流感病毒神经氨酸酶作用研究学位论文完成日期：指导教师签字：答辩委员会成员签字：硫酸岩藻聚糖和寡糖结构分析、糖芯片的构建及其与流感病毒神经氨酸酶作用研究独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任

2、何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：导师签字：签

3、字日期：年月日签字日期：年月日硫酸岩藻聚糖和寡糖结构分析、糖芯片的构建及其与流感病毒神经氨酸酶作用研究硫酸岩藻聚糖和寡糖结构分析、糖芯片的构建及其与流感病毒神经氨酸酶作用研究摘要本论文以褐藻中硫酸岩藻聚糖为研究对象，制备了硫酸岩藻寡糖及其拟糖脂，建立了硫酸岩藻多糖和寡糖芯片技术体系，并成功利用所建糖芯片探讨了其与流感病毒神经氨酸酶(NA)作用。首先，以厚叶切氏海带(Kjellmaniellacrassifolia)为原料，采用脱脂后水提取及醇沉的方法，对其中的褐藻糖胶KW进行了提取分离，利用醋酸纤维素薄膜电泳(ACME)、高

4、效凝胶渗透色谱(HPGPC)和高效液相色谱(HPLC)等对其纯度、分子量和单糖组成等理化性质进行了分析。结果表明，KW为一种高岩藻糖含量(82％)及高硫酸化(30％硫酸基)的硫酸岩藻聚糖，除了岩藻糖(Fuc)外，还含有少量的甘露糖(Man)和葡萄糖醛酸(GIcA)。经进一步傅里叶变换红外光谱(FTIR)、核磁共振波谱(NMR)和甲基化分析表明，KW主要由4一硫酸岩藻糖(F4S)和2，4一二硫酸岩藻糖(F2S4s)组成，岩藻糖残基之间均通过0【1--)3连接。采用稀酸分步降解并结合寡糖质谱解析的方法分析KW细微结构。分析结果表

5、明，ION含有两个结构不同的区域，一个是1专3连接的F4S和F2S4S区域，另一个是甘露糖(Man)与葡萄糖醛酸(GIcA)交替连接的结构区域，采用酸法降解获得了4糖至20糖，通过NMR和串联质谱技术确定了9种寡糖结构，GIcAlill-)[2Mancxl-)4GIcA{31]n．--)Man，n=l·9。利用所得硫酸寡糖，建立了两步串联质谱分析策略确定高硫酸化寡糖结构新方法，避免了传统质谱分析硫酸根取代信息缺失问题。将硫酸寡糖分别转成Na型和H型后，先以Na型寡糖为对象分析寡糖的组成和序列，再以H型寡糖在质谱条件下产生的脱

6、硫离子为母离子，分析寡糖的连接方式和硫酸根取代位置，结合H型和Na型寡糖质谱离子碎片信息推出寡糖的完整结构。利用该策略，本文确定了KW经酸降解后8种寡糖的结构，即F4S(伐i->3)F45(仪1专3)。F4S(otI--)3)F4S和F2s4s(0c1专3)F4S(仪1专3)。F4S((zI-)3)F4S，其中n=O．3。结合所得寡糖结构信息，阐明了KW的酸降解机理。在酸性环境下，岩藻糖c2位硫酸根发生脱落，非硫硫酸岩藻聚糖和寡糖结构分析、糖芯片的构建及其与流感病毒神经氨酸酶作用研究酸化与硫酸化岩藻糖残基(Fuc—Fuc4S

7、)之间糖苷键的断裂速度大于单硫酸化与二硫酸化糖残基(Fuc4S．Fuc2S4S)之间糖苷键，且均大于二个单硫酸化糖残基(Fuc4S．Fuc4S)之间的断裂速度，即坼Fuc-Fu“sl>V(Fuc4S-Fuc2S4S)>V(Fuc4S-Fuc4sl。以上述结构明确的硫酸寡糖以及其它来源寡糖为原料，采用还原胺化法制备了21种含有DHPE的开环岩藻寡糖脂，其中13个为首次获得；采用活性肟连接方法，合成了18种含有AOPE的闭环拟糖脂，其中10个为首次获得。以FITC标记多糖制备了多糖芯片，以制备的拟寡糖脂为原料，制备了岩藻寡糖mi

8、ni．糖芯片。采用糖芯片技术研究了硫酸岩藻糖与H1N1／H3N2／H5N1流感病毒NA蛋白的结合情况，并在细胞水平上对结果进行了验证。得出以下结论：NA蛋白与糖的结合方式有多种形式，电荷作用是NA蛋白与糖结合的必要条件，硫酸根的多少与结合能力正相关，乙酰化阻碍了结合；岩藻糖是流感病毒NA蛋