桔小实蝇gsts生化及分子毒理学特性研究

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1、西南大学博士学位论文桔小实蝇GSTs生化及分子毒理学特性研究姓名：胡飞申请学位级别：博士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：王进军20120602中文摘要桔小买蝇B口c抛c8m如坶口凰(Hendel)隶属双翅目Diptera，实蝇科Tepllritidae，果买蝇属B以c加cemMacquar，是一种重要的危险性果蔬害虫。鉴于桔小实蝇在生产上的经济重要性，近年来有关桔小实蝇种群遗传结构、引诱剂研发、化学防治等方面的研究日益增多。然而，长期持续、不合理的使用化学杀虫剂导致其产生了严重的抗药性。目前，桔小实蝇抗性机理方面

2、的研究主要集中于靶标酶．乙酰胆碱酯酶的生化及分子生物学特性，而对于解毒酶系与桔小实蝇抗性发展的关系知之甚少。谷胱甘肽D转移酶(91uthione孓transferase，GSTs，EC2．5．1．18)是一类多功能超基因家族酶。GSTS作为重要的解毒代谢酶，主要功能是催化一些内源性或外来有害物质的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基结合，增加其疏水性使其易于排出体外，从而达到解毒的目的。目前己知昆虫特有的GSTsDelta和Epsilon家族成员参与了昆虫对有机磷类、有机氯类和拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的形成。本学位论文以

3、桔小实蝇为研究对象，瞄准昆虫适应逆境胁迫的机理这一研究热点，系统开展了桔小实蝇GSTs生化毒理学特性、GSTs基因的全长序列克隆、转录表达模式及异源表达研究。研究结果将有助于阐明桔小实蝇对杀虫剂抗性产生和发展的分子毒理学机理，从而在实践中建立基于GSTs的自然种群抗性的分子诊断技术。旨在为桔小实蝇的可持续治理提供理论依据，同时丰富和发展昆虫抗性机理研究的科学理论和技术体系。通过近三年的研究，取得的主要研究结果如下：1桔小实蝇GSTs的纯化及生化毒理学特性1．1桔小实蝇不同种群GsTs的纯化及生化毒理学特性采用G1u

4、tathioneSepharose4B亲和层析法对桔小实蝇4个地理种群(东莞、广州、海南和云南)的GSTs进行了分离纯化和生化毒理学特性解析。结果表明，桔小实蝇4个种群GSTS纯化后的比活力相似，但广州种群的GSTs纯化回收率最低(31．54％)。聚丙酰胺凝胶电泳显示4个种群GSTs均只有一条大小为23kDa的条带。以CDNB为底物时，东莞和海南种群GSTs的‰值显著地高于广州和云南种群；海南种群GSTS的％。。值在4个种群间最高。4个种群的GSTs最适反应温度均是37oC，最适pH值为7．5。离体抑制作用测定结果

5、表明，利尿酸、四溴磺酚钠、马来酸二乙酯、双硫仑、姜黄素和高效氯氰菊酯均对桔小实蝇GSTs有很高的抑制率，而马拉硫磷和阿维菌素对桔小实蝇4个种群GSTs的抑制率均未到达50％。结果暗示GSTs可能介导桔小实蝇对高效氯氰菊酯的代谢抗性。1．2桔小实蝇不同发育阶段GSTs的纯化及生化毒理学特性采用GlutathioneSepharose4B亲和层析法对桔小实蝇不同发育阶段(三龄幼虫、蛹、成虫)GSTs进行了分离纯化和生化毒理学特性解析。结果表明，洗脱得到的桔小实蝇GSTs活性主要集中在洗脱收集到的3—5管。桔小实蝇成虫G

6、STs的总活性和比活力分别是370．76Im01．min．1和16．91nm01．min．1．肛g～，且显著高于三龄幼虫和蛹期。SDS．PAGE结果显示，桔小实蝇3个发育阶段的GSTs纯化后均获得单一条带，且分子量大小均为23l(Da。无论以CDNB或GSH为底物时，桔小实蝇幼虫期GSTs的如值均显著低于蛹和成虫期，而3个发育阶段间GSTS的‰觚无显著性差异。桔小实蝇3个发育阶段的GSTs最适反应温度均是37。C，最适pH值为7．5。利尿酸(1．15州)和马来酸二乙酯(0．60州)对桔小实蝇成虫期GSTs的厶。显著

7、地低于其余两个发育阶段；四溴磺酚钠对桔小实蝇不同发育阶段GSTs的厶。无显著差异；双硫仑对蛹和成虫期GSTs的厶。均显著地高于三龄幼虫，而蛹和成虫间无显著差异；姜黄素对桔小实蝇成虫GSTs的厶o(101．78州)显著地高于三龄幼虫和蛹期；高效氯氰菊酯对蛹和成虫期GSTs的厶o(o．90和O．78r11M)显著地高于幼虫阶段；但马拉硫磷和阿维菌素对桔小实蝇3个发育阶段的GSTs的抑制率均未到达50％。结果暗示桔小实蝇幼虫期对杀虫剂高效氯氰菊酯相对更为敏感。2桔小实蝇GsTs基因的克隆与序列分析基于桔小实蝇转录组数据，

8、利用RACE技术，从桔小实蝇体内分离克隆了18个GSTs基因的cDNA全长序列。通过序列分析，确定了这18个GSTs基因的开放阅读框，并推导了其编码的氨基酸序列。进一步利用Protpar锄等生物信息学软件分析了推导蛋白质的理化性质。依据其在细胞中的定位，将这18个GSTs基因分为胞质型和微粒体型两大类，分别包含17个和1个基因。根据黑腹果蝇、冈比亚按蚊、埃及