基于生物质谱技术的hiv-1 tat蛋白生物活性的代谢组学研究

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1、第二军医大学博士学位论文基于生物质谱技术的HIV--1Tat蛋白生物活性的代谢组学研究姓名：廖文婷申请学位级别：博士专业：药物分析学指导教师：柴逸峰；潘卫201205基于生物质谱技术的HIv-1Tat蛋白生物活性的代谢纽学研究摘要HIV-1Tat蛋白是病毒产生的重要调控蛋白和致病因子，在HIV-1的复制、扩散和致病中起重要作用。HIV-1感染靶细胞后，细胞质中合成的Tat可进入细胞核反式激活HIV-1RNA的转录，从而激活HIV-1的增殖。此外，Tat还可被感染细胞分泌到胞外发挥多种细胞外功能在致病中起重要作用，如抑制免疫细胞的增值、分化、诱导其凋亡；促进病毒播散；促进卡波式肉瘤肿瘤细胞的生长

2、；诱发神经损伤等。鉴于其多种生物学活性，Tat被认为是“病毒毒素”，是药物干预和治疗性疫苗的重要靶标。多个研究发现，在HIV感染者中代谢紊乱综合症的发生率显著高于『F常人群，如脂代谢异常、胰岛素抵抗、心脏代谓}紊乱、磷酸代谢异常和损伤的葡萄糖耐受等。尽管已有研究发现多种危险因素，但其病因仍然不清楚。而有多种生物学功能的HIV．1Tat蛋白在其中所起的作用值得研究和探讨。代谢组学是自上而下的系统生物学方法，它是对一个生物体系中所有小分子代谢物进行定性定量分析的整体性方法，已广泛应用于疾病诊断及作用机理、药物毒理学、药效评价、基因功能及中药质量控制等领域。相对于转录组和蛋白组来说，其分析对象的理化

3、性质更加多样，是一个非常复杂的分析体系。代谢物组中的化合物在性质(从强极性到非极性)和浓度(从mM到pM)上的巨大差异对现有的分析技术是一个重大的挑战。在当前的技术条件下仅凭一种分析技术很难建立无偏的全局的代谢组学分析方法。因此为了获得更加广泛的代谢物信息，近年来多种互补的分析方法相结合广泛应用到代谢组学研究中，如质谱(MS)和核磁共振(NMR)结合；气相色谱．质谱(GC．MS)和液相色谱．质谱结合(LC．MS)；亲水相互作用色谱．质谱(HILIC．MS)和反相液相色谱．质谱(I冲LC—MS)相结合等。本研究以GC—MS、RPLC．MS和HILIC—MS联用技术结合化学计量学多元方法为手段，以

4、HIV-1Tat为研究对象，从整体动物和细胞水平阐明代谢组学方法在HIV．1Tat致病机制中的应用。主要内容如下：一、HIV-1Tat在大肠杆菌中的表达、纯化及生物活性鉴定在本课题组构建的HIV-1HXB2株Tat质粒的基础上，通过PCR方法合成HIV-1IIIB株BHl0克隆TatDNA序列，并构建其原核表达质粒tat—pET21b，转化到表达宿主菌BL21(DE3)。经IPTG诱导，得到的重组蛋白的表达量占细菌总蛋白的约15％；第二军医大学博士学位论文重组表达的Tat蛋白经Ni．NTA亲和柱和SP．Sepharose离子交换柱纯化，得到了纯度约90％的Tat蛋白。经Westem鉴定在约15

5、kD得到阳性的蛋白表达条带。鲎试剂盒检测内毒素LPS的含量约为O．05EU／嵋，满足LPS限量要求。细胞模型上鉴定纯化的Tat蛋白保留了生物学活性。二、基于Gc．MS技术的HIv-1Tat诱导的ICJI小鼠的血清代谢组学研究Tat蛋白由感染的细胞释放，发挥多种生物学作用如破坏免疫系统、促进病毒播散和致病性。目前Tat蛋白对代谢物的影响还未见报道。本课题以对照小鼠血清和HIV-1Tat处理的小鼠血清为分析对象，研究建立了内源性代谢物谱的GC．MS分析方法，并利用NIST2002质谱数据库对检测到的代谢物进行快速鉴定。在综合考察供试品制备方法、衍生化条件和色谱分析条件的基础上，获取了一个峰容量大、

6、分离效果佳的GC．MS分析条件，并对其进行了方法学验证。研究结果表明，所建立的GC．MS方法可较好地表征生物样本的代谢物谱特征，分析结果稳定可靠，可用于代谢组学研究。采用建立的GC．MS联用技术检测Tat诱导的小鼠血清中的代谢物，并用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法分析(PLS．DA)法对所获得的代谢组数据进行模式识别。研究结果显示，Tat可诱导小鼠血清16种代谢物显著变化，它们涉及氨基酸代谢、三羧酸循环、脂肪酸代谢等多条代谢通路，为Tat致病机制的阐释和艾滋病的治疗提供了新的线索。三、基于LC／GC．MS和定量PCR技术的HlV-lTat诱导Jurkat细胞的代谢组学研究HIV-1Tat蛋

7、白由感染的细胞释放，作用于邻近未感染的T淋巴细胞诱导多种病理效应。上一章我们已经在小鼠模型上用基于GC．MS的代谢组学方法揭示了Tat可诱导体内多种代谢物发生变化，为了深入研究其干扰机制，本章我们在体外以HIV-11'at处理的JurkatT淋巴细胞为研究对象，采用基于GC．MS、RPLC．MS和HILIC．MS相结合的代谢组学方法检测Tat处理的JurkatT淋巴细胞胞内及胞外代谢物，并用PCA