喹赛多对恒化器模型中人肠道菌群的影响

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1、华中农业大学硕士学位论文喹赛多对恒化器模型中人肠道菌群的影响姓名：郭卫革申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：袁宗辉201206喹赛多对恒化器模型中人肠道菌群的影响研究生：郭卫革导师：袁宗辉教授(r华中农业大学国家兽药残留基准实验室(HZAU)／农业部食品安全评价重点开放实验室，中国武汉430070)摘要喹赛多是喹嗯啉类一种新型的抗茵促生长剂，能促进畜禽及水产动物生长、提高动物生产性能，并能有效降低疾病的感染率，安全低毒高效的特性使其在畜牧业中有较好的研究及应用前景。虽然实验室前期对喹赛多的代谢及残留消除规律进行了系统研究，毒理学方面的研究

2、显示为一类安全性较高的药物，而目前还未从微生物学安全性的角度进行分析，因此为了保证食品安全，有必要考察喹赛多残留是否对人的肠道菌群有负面效应，对肠道菌群结构、代谢活性、耐药率及定植屏障功能的发挥是否有干扰，同时抗菌药微生物影响作用又是食品安全评估中要求进行的一项重要内容，因此本试验应用离体恒化器模型，系统评价不同剂量喹赛多对人肠道微生物菌群的作用，丰富其微生物学安全性方面的资料，为喹赛多申报和进一步推广使用提供全面科学的资料。1喹赛多对肠道菌群的影响本研究采用FDA推荐使用的连续培养系统研究喹赛多对人结肠菌群的影响。首先进行喹赛多及其主要代谢物对

3、肠道菌株(大肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、脆弱拟杆菌)的药敏试验，发现喹赛多主要代谢物Cyl、Cy2、Cy4、Cy6、Cyl0、Cyl2与原形喹赛多相比均没有抗菌活性，因此模型系统中仅考虑喹赛多对结肠菌群的微生物学效应。根据喹赛多对临床分离的四种优势菌的药敏的范围是1．16pg／mL，设计了包含此范围的一系列不同浓度0．5．128p,g／mL在厌氧箱中与粪样孵育，通过对四种优势菌数量及兼性需氧厌氧菌(大肠杆菌、肠球菌)耐药率考察，最终确定终浓度为41,tg／mL、161．tg／mL、3299／mL、1281．tg／mL在模型中进行预试。模型接种粪样后

4、第7d达到平衡，于第13d添加终浓度为499／mL、161．tedmL、321．tg／mL、128“g／mL的喹赛多，考察不同浓度作用下对四种优势菌(大肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、脆弱拟杆菌)数量影响、短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)影响及兼性需氧厌氧菌耐药率变化(大肠杆菌、肠球菌)，连续给药7天，第21d接种108CFU／mL华中农业大学2012届硕士学位论文的鼠伤寒沙门氏菌lmL，接种三天，通过采样计数沙门氏菌的数量来判断肠道菌群的定植屏障功能是否破坏。在4I_tg／mL、16}tg／mL剂量下发现对肠道代表菌株的数量、短链脂肪酸、兼性需氧厌氧菌

5、耐药率及沙门氏菌数量均在95％置信范围内，也就是说，这两个剂量组对肠道菌群没有影响。加药期间这两个剂量组下大肠杆菌数量保持在106CFU／mL浓度，肠球菌浓度104CFU／mL，双歧杆菌、脆弱拟杆菌浓度101CFU／mL，均在95％置信范围内，也均在正常生理值范围内；对鼠伤寒沙门氏菌的数量计数分析，也发现4pg／mL、16I_tg／mL剂量下沙门氏菌数量与对照组相比没有差异，在模型内没有增值的趋势。相反地，32I-tg／mL、128Itg／mL这两个剂量组对四种观测指标则有不同程度的影响。加药期间对四种代表菌株数量均有影响，厌氧菌(双歧杆菌、脆弱

6、拟杆菌)数量降低程度更明显；大肠杆菌、肠球菌耐药率增加；沙门氏菌数量与对照组相比有差异，在模型中有增值的趋势，肠道菌群的定植抗力作用受到破坏；但是321．tg／mL、1281xg／mL剂量组并没有影响短链脂肪酸的浓度，加药期间乙酸、丙酸、丁酸的浓度均在95％置信范围内，可能与模型系统不能模拟肠道吸收功能有关，使短链脂肪酸浓度变化不是很明显。在恒化器模型中通过对41．tg／mL、16pg／mL、321．tg／mL、128I_tg／mL剂量的考察结果显示，161上g／mL剂量组对考察的指标没有影响，不会扰乱人肠道菌群的平衡。2大肠杆菌及肠球菌耐药方式

7、分析模型加药前期(第8—13d)及加药期(第14．20d)从模型中采取样品分离耐药大肠杆菌和肠球菌，加药前期321．tg／mL模型中分离大肠杆菌和肠球菌各10株；128pg／mL剂量组大肠杆菌和肠球菌各分离9株。加药期间，32肛g／mL浓度下耐药大肠杆菌和肠球菌各14株，128p．g／mL剂量组耐药大肠杆菌和肠球菌各分离13株。首先对分离的耐药大肠杆菌、肠球菌进行耐药表型分析，发现模型加药前后分离大肠杆菌对喹嗯啉类药物耐药严重(MIC>641上g／mL)，此外还对p-内酰胺类药物耐(MIC>__12899／mL)。设计引物对分离耐药大肠杆菌和肠球

8、菌进行喹嗯啉类耐药基因oqxAB扩增，检测我们临床的分离的耐药菌中是否有这种耐药基因，目的片段oqxA和oqxB的大小分别是670bp和